Development and Maintenance of Serum-free 배아체(Development and Maintenance of Serum-free embryoid body)

초록

출처: Phillips, A. W., et al. 생리학적으로 관련된 분석을 사용하여 3차원 줄기 세포 배양 심문을 위한 HiPSC 유래 혈청 무료 배아 본체 개발. J. Vis. 특급. (2017).

이 비디오는 다양한 무혈청 분화 배지 또는 DM을 사용하여 신경 전구 세포에서 무혈청 배아체(SFEB)를 개발하는 절차를 설명합니다. DM-2는 뉴런의 성숙 및 배열을 촉진하여 SFEB를 형성하는 반면, DM-3은 추가 성장 유지를 위해 사용됩니다.

프로토콜

1. SFEB(Serum-Free Embryoid Body) 유도(그림 1)

1. 40μm 세포 배양 삽입물을 6웰 플레이트에 배치하고 응집체를 추가하기 최소 1시간 전에 1mL 분화 배지 1(DM1)(재료 표)을 추가합니다.
2. 200μL 너비의 입 끝을 사용하여 20μL 배지를 가진 신경전구 세포 응집체를 40μm 세포 배양 삽입체에 옮기고 배지를 DM2(Table of Materials)로 변경합니다.
   메모: 세포 배양 삽입물은 웰 바닥에서 약간 떨어져 있으며 플라스틱 프레임을 가로질러 매달려 있는 폴리테트라플루오로에틸렌 멤브레인으로 구성된 특수 삽입물입니다. 이 멤브레인은 생체 적합성이 있으며 상단에 배치된 SFEB로의 영양분 및 산소 수송을 효율적으로 유지할 수 있습니다. 그들은 일반적으로 쥐나 쥐에서 채취한 유기형 해마 절편 배양과 함께 사용됩니다.
   1. 4-6개의 응집체를 하나의 세포 배양 삽입체로 옮기고 응집체 사이에 적절한 공간을 확보합니다. 미세한 피펫 팁(예: 200μL 팁)을 사용하여 과도한 용액을 최대한 제거합니다.
      참고: SFEB 주변에서 용액이 제거될 때 세포 배양 삽입물에서 SFEB가 이동하므로 SFEB를 잠시 방해하는 것은 허용됩니다.
   2. 37°C, 95% 습도 및 5% CO2에서 1mL의 DM2로 배양액을 유지합니다. 피펫을 사용하여 배지의 3/4을 제거하고 3/4의 새 배지로 교체하여 격일로 배지의 75%를 교체합니다. 예를 들어, 750μL의 배지를 제거하고 750μL의 새 배지를 추가합니다.
3. 배양 14일 후 격일로 75% 배지 변화로 DM3 배지(Table of Materials)로 전환하고 16일 동안 더 배양합니다.
4. 세포 배양 삽입물의 SFEB를 30일 이상 유지하려면 60일, 90일 및 120일 동안 격일로 배지를 교체하십시오.
   메모: SFEB는 직경이 약 1,000μm까지 자라며 두께는 일반적으로 100-150μm입니다.
5. 200 μL 입구가 넓은 피펫 팁을 사용하여 배지를 부드럽게 피펫팅하여 인서트에서 SFEB를 분리합니다. SFEB를 옮기려면 입이 넓은 피펫 팁을 사용하여 몸체를 피펫 팁으로 부드럽게 흡입합니다. SFEB를 피펫 팁에 로드한 후 12웰 플레이트로 부드럽게 옮기고 웰당 300μL 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척합니다.

결과

그림 1: SFEB 성장 및 확장 중 중간 변화 및 단계의 타임라인.

SFEB가 인서트로 전송된 후 14일과 28일 in vitro(DIV)에 두 번의 매체 변화를 겪습니다. 일반적으로 DIV 30, 60 및 90에서 실험을 위해 수확됩니다. 상단 삽입은 이 프로세스의 여러 단계를 보여줍니다. 스케일 바 = 1,000 μm (맨 왼쪽); 1,000 μm (DIV 20); 600 μm (디브 30); 300μm(단일 SFEB).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
SFEB 신경 세포 분화 세포 배양 배지. 시약. 구성 요소
STEMdiff 신경 유도 매체(hiPSC 배지)	스템셀 테크놀로지스	0-5835	250ml
PluriQ ES-DMEM 매체(MEF 매체)	글로벌스템	GSM-2001
DM1 미디어 구성 요소
D-MEM/F-12 (1X), 글루타맥스 액체, 1:1	인비트로젠	10565018	385ml
Knockout 세럼 교체	인비트로젠	10828028	20% 100ml
펜/연쇄상구균	인비트로젠	15140122	5 밀리람베르트
글루타맥스 200mM	인비트로젠	35050061	5 밀리람베르트
MEM 비필수 아미노산 용액 10mM(100X), 액체	인비트로젠	11140050	5 밀리람베르트
2-메르캅토에탄올(1,000X), 액상	인비트로젠	21985023	900ul
DM2 미디어 구성 요소
D-MEM/F-12 (1X), 글루타맥스 액체, 1:1	인비트로젠	10565018	500ml
글루타맥스 200mM	인비트로젠	35050061	5 밀리람베르트
펜/연쇄상구균	인비트로젠	15140122	5 밀리람베르트
N-2 보충제(100X), 액상	인비트로젠	17502048	10 밀리람베르트
DM3 미디어 컴포넌트
NEUROBASAL 배지 (1X), 액상	인비트로젠	21103049	500ml
B-27 보충제에서 비타민 A(50X)를 뺀 액상	인비트로젠	12587010	10 밀리람베르트
글루타맥스 200mM	인비트로젠	35050061	5 밀리람베르트
펜/연쇄상구균	인비트로젠	15140122	5 밀리람베르트
부품/재료
	밀리셀	PICM0RG50
인산염 완충 식염수(PBS)	써모피셔	10010023	500 밀리리터

년 년