Constructing Patterned Neuronal Circuits on a Multi-Electrode Array

초록

출처: Kanner, S., et al. 기능적으로 상호 연결된 회로로 구성된 모듈식 뉴런 네트워크의 설계, 표면 처리, 세포 도금 및 배양. J. Vis. 특급 (2015)

이 비디오는 모듈러 뉴런 네트워크를 구축하기 위해 패턴화된 다중 전극 어레이(MEA)에서 뉴런 세포를 배양하는 과정을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 신호 전달 및 세포 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

1. 다중 전극 어레이(MEA) 준비

1. 다음 순서로 MEA 청소(재료 표):
   1. 수돗물로 씻고 농축 효소 세제에 3회 초음파 처리합니다.
   2. 증류수에 3회 초음파 처리합니다.
   3. 증류수(후드, 1,000μl 팁)로 3회 세척하고 자외선(UV) 아래에 30분 동안 놓습니다.
2. 네트워크 준비 지원:
   1. 설계된 지원 네트워크 금형을 준비합니다.
      1. 폴리디메틸실록산(PDMS)을 12웰 플레이트(직경 22mm)에 붓습니다.
      2. PDMS가 경화되면 금형을 제거하고 메스를 사용하여 중간에 구멍을 뚫어 링 모양을 만듭니다.
      3. 설계된 지지 네트워크 금형을 MEA 중앙에 배치하고(그림 1A) 실온(RT)에서 2시간 동안 폴리-D-라이신(PDL)으로 나머지 표면을 덮습니다.
   2. 피펫을 사용하여 PDL을 제거하고 증류수로 세척합니다.
   3. 곰팡이를 제거하고 건조시킵니다(그림 1A).
3. 다음과 같은 방법으로 스텐실을 MEA에 정렬합니다.
   1. 지정된 마이크로 매니퓰레이터에 스텐실을 놓습니다. 도립 현미경을 사용하여 패턴화된 구조를 전극에 정확하게 정렬하고 MEA 표면에 놓일 때까지 스텐실을 내립니다(그림 1B).
      메모: 잘 세척된 MEA와 접촉하면 PDMS와 MEA 자체 간에 경쟁력 있는 접착력이 제공됩니다.
   2. 마이크로 매니퓰레이터를 들어 올리고 필요한 경우 핀셋을 사용하여 PDMS 위에 소량의 압력을 가하여 MEA에서 분리되지 않도록 합니다.
   3. 스텐실을 MEA 표면에 부드럽게 누르고 현미경을 사용하여 스텐실이 단단히 부착되고 잘 정렬되었는지 확인합니다(그림 1C-D).
4. MEA를 진공 챔버에 15분 동안 넣고 스텐실에 PDL 1ml 방울을 떨어뜨립니다.
5. 진공 챔버에 각각 20분씩 2회 삽입합니다. 인큐베이터에서 PDL을 O/N을 건조시키도록 둡니다.
6. 도금하기 전에 MEA에서 PDMS 스텐실을 제거하고 멸균수를 사용하여 세척하십시오. UV 조명 아래에 7분 동안 놓습니다.

2. 도금

1. 혈구계를 사용하여 도금에 필요한 세포 수를 계산합니다.
   1. 계수실(혈구계)이 깨끗한지 확인하고 그 위에 덮개 슬립을 놓습니다(알코올을 사용하여 청소).
   2. 190μl의 도금 배지에 10μl의 세포 현탁액을 희석합니다(희석 1:20).
   3. 희석된 세포 10μl를 계수 챔버의 가장자리에 로드하고 세포를 천천히 피펫으로 빼내어 챔버가 자체적으로 채워지도록 합니다.
   4. 도립 현미경을 사용하여 혈구계 그리드를 시각화합니다. 직접 계수로 챔버의 세포 수를 결정합니다(건강한 세포는 둥글어야 함). 가장자리를 가로지르지 않는 큰 사각형 안의 셀을 세십시오.
   5. 세포 농도 계산 :
      총 세포 수/1000μl = 희석 계수× 계수된 총 세포 × 10⁴(혈구계 면적).
      메모: 예를 들어, 희석 계수가 20이고 계수된 총 세포가 100:
      인 경우 100 × 20 × 10⁴ = 0.1 x 10⁷ cells/1,000 μl 또는 1 x 10⁶/100 μl. 0.75 x 10⁶ 세포를 플레이트하려면 세포에서 75 μl를 추출합니다.
2. 단일 MEA 또는 페트리 접시당 도금에 필요한 세포 수를 취하고, 응집을 방지하기 위해 세포를 재현탁하고, 패턴화된 영역 위의 중앙에 플레이트를 만듭니다(필요한 경우 세포를 배지에서 희석할 수 있음). MEA의 경우 중간에 100μl 방울을 놓습니다. 커버슬립의 경우 중간에 1,000μl 방울을 놓습니다.
3. 도금된 셀을 37°C에서 40분 동안 배양합니다.MEA당 최대 1ml, 커버슬립당 최대 2ml까지 도금된 셀에 도금 매체를 추가합니다.
4. 37 °C에서 유지하고 4일마다 0.5 Pen-Strep, 2% B-27 및 0.75% 글루타맥스가 풍부한 신선한 성장 배지로 희석합니다.
5. 6/7 DIV에서 섬 사이의 연결을 확인한 후 10μl/ml FUDR(12.5ml MEM(Minimum Essential Medium Eagle)에 25mg 데옥시우리딘 + 62.5mg 우리딘) 또는 기타 유사분열 방지제로 배지를 희석하여 신경교세포의 과증식을 방지합니다.

결과

그림 1. PDMS는 MEA에 증착을 구조화합니다. (A) MEA에 장착된 링 모양(빨간색 화살표로 표시)이 있는 PDMS 금형. 곰팡이는 지지 신경 세포망으로 향하고 배양 영역의 주변에 위치한 영역을 코팅하는 데 사용됩니다(이는 MEA에 장착되고 녹색 화살표로 표시된 링에 의해 제한됨). (B) 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 MEA에서 PDMS 스텐실을 정렬하는 단계. (C) 정렬 후 MEA에 증착된 PDMS 스텐실. (D) 10배 배율을 사용한 MEA의 PDMS 스텐실 이미지(전극 간 거리는 500μm). 전극에 따라 스텐실의 구멍을 기록하는 것이 가능합니다. 세포 접착을 선호하는 접착 층은 개방 된 영역에만 증착됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PDMS, 실가드 184	다우코닝
Nalgene 진공 챔버	열	5305-0609
폴리-D-라이신 PDL	시그마	P7886
12 우물 문화 플레이트	시그마	CLS3336
5-플루오로-2'-데옥시우리딘	시그마	F0503
MEA1060-Inv-BC	다중 채널 시스템
TC02	다중 채널 시스템
펜 스트렙	생물 산업 Beit Haemek	03-033-1씨
나-27	지브코	17504044
글루타맥스	지브코	제35050-038
MEM 최소 필수 매체 - 이글	생물 산업 Beit Haemek	01-025-1B
마이크로 전극 어레이 4Q	다중 채널 시스템	60-4QMEA1000iR-티-PR	청소 설명서 : http://www.multichannelsystems.com

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