방법 논문

공학적 인간 유도 만능 줄기세포를 기능적 운동 뉴런으로 분화시키기

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Garone, M. G., et al. PiggyBac 벡터를 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 인간의 iPSC를 운동 뉴런으로 분화하는 과정을 보여줍니다. 그 이유는 특정 전사 인자를 발현하기 위해 유전적으로 변형된 iPSC를 활용하는 것입니다. 독시사이클린을 함유한 배지에서 배양하면 이 항생제는 전사 인자의 발현을 유발하여 운동 뉴런 전구체로의 iPSC 분화를 촉진합니다. 궁극적으로, 전구 세포는 성숙하고 기능적인 운동 뉴런을 생성하기 위해 뉴런 배지에서 배양됩니다.

프로토콜

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1. 인간 iPSC의 유지 관리

  1. 매트릭스 코팅 플레이트의 준비
    1. 5mL 매트릭스 바이알 1개(재료 표 참조)를 4°C에서 밤새 해동합니다. 원래 매트릭스 스톡은 서로 다른 스톡 농도로 제공되며, 부분 표본은 데이터시트에 표시된 희석 계수에 따라 만들어지며 개별 로트에 따라 다릅니다. 매트릭스의 조기 겔화를 방지하기 위해 바이알과 튜브를 얼음처럼 차갑게 유지하는 것이 중요합니다. 매트릭스를 얼음 위에서 미리 냉각된 cryotubes의 부분 표본으로 분배합니다. 사용하지 않은 부분 표본은 -20 °C에서 동결합니다.
    2. 얼음 위에 부분 표본 1개를 놓고 약 2시간 동안 해동합니다.
    3. 50mL 코니컬 튜브에 20mL의 차가운 DMEM/F12로 매트릭스의 부분 표본을 희석합니다.
    4. 잘 섞어 희석된 매트릭스 1mL를 35mm 접시에 분배합니다(다른 접시의 표면적당 동일한 양).
    5. 코팅을 위해 희석된 매트릭스가 들어 있는 접시를 실온에서 1시간 동안 보관하십시오.
      메모: 파라필름으로 밀봉된 접시는 4°C에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 원액(20mL) 및 부드러운 세포 해리 시약의 1x 작업 분취액 준비(재료 표 참조).
    1. PBS에 분말을 10mg/mL로 용해(Ca2+/Mg2+ 무료)
    2. 필터는 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 멸균됩니다.
    3. 20개의 부분 표본(각 1mL)을 준비하고 -20°C에서 보관합니다.
    4. 사용하기 전에 PBS(Ca2+/Mg2+ free)에서 1mg/mL(1x 작업 분취량)로 1개 분취량을 희석합니다<> 참고: 1x 작동 부분 표본은 4°C에서 2주 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 인간 iPSC를 전달.
    1. 시작하기 전에: 4°C에서 보관하는 경우 매트릭스 코팅 플레이트를 37°C의 인큐베이터에서 20-30분 동안 예열하고 필요한 양의 인간 iPSC 배지(재료 표 참조)만큼 실온에서 예열합니다. DMEM/F12를 예열합니다.
    2. 흡인 배양 배지.
    3. PBS(Ca2+/Mg2+ free)로 iPSC를 헹굽니다.
    4. 1x 부드러운 해리 용액(35mm 접시의 경우 0.5mL)을 추가합니다. 군체의 가장자리가 플레이트에서 분리되기 시작할 때까지 37 ° C에서 일반적으로 3-5 분 동안 배양하십시오.
    5. 부드러운 해리 용액을 흡인하고 iPSC 콜로니가 분리되지 않도록 주의합니다.
    6. DMEM/F12(35mm 접시의 경우 2mL)로 세포를 세척하고 세포가 분리되지 않도록 주의하면서 흡인합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
    7. human iPSC 배지(35mm 접시의 경우 1mL)를 추가합니다.
    8. 세포 리프터로 콜로니를 부드럽게 분리하고 15mL 튜브로 옮깁니다.
    9. P1000 피펫터로 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포 덩어리를 부드럽게 끊습니다.
    10. 매트릭스 코팅된 플레이트에서 상등액을 흡입합니다.
    11. 인간 iPSC 배지의 적절한 배양량에 세포를 파종합니다. 분할 비율은 라인마다 다를 수 있으며 약 1:4-1:8입니다. 매체를 매일 교체하십시오.

2. NIL 및 NIP 유도 iPSC 라인 생성

  1. 세포 transfection
    1. PBS(Ca2+/Mg2+ free)로 세포를 헹굽니다.
    2. 세포 해리 시약(재료 표 참조)(35mm 접시의 경우 0.35mL)을 추가하고 단일 세포가 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다(5-10분).
    3. P1000 피펫터로 위아래로 3-4회 피펫팅하여 세포 분리를 부드럽게 완료합니다.
    4. 15mL 튜브에 모으고 PBS(Ca2+/Mg2+ free)를 10mL에 추가합니다. 세포를 세십시오.
    5. 106 세포를 펠렛화하고 100μl의 Buffer R에 재현탁합니다(세포 electroporation 키트에 포함, 재료 표 참조).
    6. transfection을 위한 플라스미드 DNA 추가: 4.5 μg의 transposable vector(epB-Bsd-TT-NIL 또는 epB-Bsd-TT-NIP12) 및 0.5 μg의 piggyBac transposase plasmid.
    7. 제조업체의 지침에 따라 이전에 설명한 대로 1,200V 전압, 30ms 너비, 1펄스로 셀 electroporation 시스템(재료 표 참조)과 교환합니다. 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10μM Y-27632(ROCK 억제제, 재료 표 참조)가 보충된 인간 iPSC 배지에 세포를 파종합니다.
  2. 항생제를 사용한 선택
    1. transfection 2일 후 배양 배지에 5μg/mL blasticidin을 첨가합니다.
    2. transfection되지 않은 대부분의 세포는 blasticidin 선택 후 48시간 이내에 사멸합니다. 세포를 최소 7-10일 동안 blasticidin에 보관하여 게놈에 전이유전자를 통합하지 않은 세포를 역선택합니다.
    3. transfection된 세포를 서로 다른 수의 전이유전자와 서로 다른 통합 부위를 가진 세포로 구성된 혼합 집단으로 유지하거나 단일 클론을 분리할 수 있습니다.
    4. Ngn2에 대한 전이유전자 특이적 프라이머와 함께 RT-PCR에 의한 1μg/mL 독시사이클린 유도 시 전이유전자의 효과적인 발현을 확인하기 위한 추가 접시를 준비한다(앞으로: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; 역방향: GAAGGAGGAGGAGGGCTCGACT).
    5. 이 단계에서 인간 iPSC를 위한 동결 매체에서 새로운 NIL- 및 NIP-iPSC 라인의 재고를 동결합니다(재료 표 참조).

3. 운동 뉴런 분화

  1. 설명된 대로 세포 해리 시약으로 세포를 해리합니다(단계 2.1.1.-2.1.3.). 해리된 세포를 15mL 튜브에 모으고 5가지 부피의 DMEM/F12로 희석합니다. 세포를 펠렛화하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 인간 iPSC 배지에 재현탁합니다. 매트릭스로 코팅된 접시의 세포와 씨앗을 62,500 cells/cm2의 밀도로 계산합니다.
  2. 다음 날, 배지를 1x 안정 L-글루타민 유사체, 1x 비필수 아미노산(NEAA) 세포 배양 보충제 및 1μg/mL 독시사이클린을 함유한 0.5x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12로 교체합니다. 이는 차별화의 0일차로 간주됩니다. 1일차에는 배지와 독시사이클린을 새로 고칩니다.
  3. 2일차에 배지를 5μM DAPT, 4μM SU5402 및 1μg/mL 독시사이클린을 포함하는 Neurobasal/B27 배지(1x B27, 1x 안정적인 L-글루타민 유사체, 1x NEAA 및 0.5x 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Neurobasal 배지)로 변경합니다(재료표 참조). 5일차까지 매일 배지와 독시사이클린을 새로 고칩니다.
  4. 5일차: 세포 해리 시약을 사용한 세포 해리(재료 표 참조).
    1. PBS(Ca2+/Mg2+ free)로 세포를 헹굽니다.
    2. 세포 해리 시약(35mm 접시의 경우 0.35mL)을 추가하고 전체 세포 단층이 접시에서 분리될 때까지 37°C에서 배양합니다.
      단세포는 배양 중에 분리되지 않습니다.
    3. 1mL의 DMEM/F12를 추가하고 15mL 튜브에 세포를 수집합니다.
    4. P1000 피펫터로 위아래로 10-15회 피펫팅하여 세포 분리를 부드럽게 완료합니다.
    5. DMEM/F12 4mL를 추가하고 세포를 계수합니다.
    6. 이 단계에서 제조업체 지침에 따라 세포 동결 매체(Table of Materials(재료 표 참조)에서 운동 뉴런 전구
      7. 세포를 동결합니다.
    7. 세포를 펠렛화하고 10μM ROCK 억제제가 보충된 뉴런 배지(20ng/mL BDNF, 10ng/mL GDNF 및 200ng/mL L-아스코르브산이 보충된 Neurobasal/B27 배지, 재료 표 참조)에 재현탁합니다.
    8. poly-ornithine/laminin- 또는 대안적으로 100,000 cells/cm2 밀도의 매트릭스 코팅 지지대에 세포를 파종합니다. 면역염색 분석을 위해 폴리머 커버슬립이 있는 μ-Slide 플라스틱 지지대(재료 표 참조)를 사용합니다.
  5. 6일차에는 배지를 ROCK 억제제가 없는 새로운 뉴런 배지로 변경합니다. 다음 날에는 3일마다 매체의 절반을 새로 고칩니다. 배양 배지는 표면에서 분리되지 않도록 매우 조심스럽게 교체해야 합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

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