인간 각막 섬유아세포와 뉴런의 3D 공동 배양 모델 생성

초록

출처: Sharif, R., et al. 각막 조직 공학: 인간 각막의 기질-신경 상호 작용의 체외 모델. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 일차 인간 각막 섬유아세포와 분화된 신경 세포의 3차원 공동 배양 모델 시스템을 생성하는 기술을 보여줍니다. 이 공동 배양 시스템은 기질-신경 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 1차 HCF(인간 각막 섬유아세포) 배양 및 3D 구조 어셈블리

1. 이전에 EMEM 10% FBS, 1% 항생제/항진균제에서 배양한 외식식물에서 3D 구조를 조립하고 HCF를 통과시키고 계산합니다.
2. 3D 구조체의 0.4μm 공극이 있는 폴리카보네이트 멤브레인 인서트에 약 1 x 10⁶ cells/well의 1차 HCF를 시딩하고, 구조체 상단에 1.5mL의 신선한 EMEM 10% FBS 1% 항생제/항진균제를 시딩합니다. 각 구성제의 바닥에 동일한 배지 1.5mL를 더 추가합니다.
3. 세포 파종 24시간 후, 각 구조체의 상단에 1.5mL, 하단에 1.5mL를 첨가하여 0.5mM 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(비타민 C)으로 자극한 EMEM 10% FBS 1% 항생제/항진균제로 세포를 배양합니다.
4. 인큐베이터에서 37 ° C, 5 % CO₂에서 3 주 동안 배양물을 유지하고 전체 연구 기간 동안 격일로 신선한 배지를 공급합니다. 더 이상의 통과는 필요하지 않습니다.

2. 세포 분화 및 공동 배양

1. 3주 후, 10% FBS, 1% 항생제/항진균제 및 0.5mM 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(비타민 C)을 함유한 EMEM 1.5mL를 포함하는 이전에 조립된 3D 구조체 위에 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포 8 x 10³ cells/well을 추가합니다.
   1. 세포 분화를 시작하기 전에 SH-SY5Y 신경모세포종 세포가 각막 기질 세포 위에서 최소 24시간 동안 성장하도록 합니다.
2. 구조체 위에 1% FBS와 1.5mL의 10μM 레티노산이 함유된 EMEM으로 세포를 자극하여 SH-SY5Y 세포 분화를 시작합니다. EMEM 10% FBS 1% 항생제/항진균제 0.5mM 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(비타민 C) 1.5mL를 구축물 바닥에 추가합니다. 레티노산 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
   1. 이 분화 배지에서 세포를 5일 동안 계속 배양합니다.
3. 세포가 분화 단계에 도달하면, 구조물 상단에 추가하여 2nM의 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)와 EMEM에 첨가된 1% 항생제/항진균제를 포함하는 1.5mL의 무혈청 배지로 세포를 전환합니다. EMEM 10% FBS 1% 항생제/항진균제 0.5mM 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산(비타민 C) 1.5mL를 구축물 바닥에 추가합니다. BDNF 단계는 어두운 곳에서 수행해야 합니다.
4. 추가 분석을 위해 처리하기 전에 추가로 2일 동안 세포를 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Dulbecco의 인산염 완충 용액 (1X)	Life Technologies의 Gibco	14190-144
멸균 겸자	피셔 사이언티픽	Tel.: 13-812-42	Fisherbrand Dissecting Extra-Fine-Pointed 파편 집게
단일 가장자리 면도날	페르소나	270100
멸균 수술용 메스 칼날 No.10	깃털 수술 블레이드	2976#10
독수리의 최소 필수 매체	증권 시세	2003년 30월 30
소 태아 세럼	애틀랜타 바이오로직스	S11550	배지 준비에는 10% FBS가 필요합니다.
항생제-항진균제(100X)	Life Technologies의 Gibco	제15240-062	1% 항생제 - 배지 준비에 항진균제가 필요합니다.
0.05% 트립신 EDTA(1X)	Life Technologies의 Gibco	25300062
0.4μm 기공이 있는 폴리카보네이트 멤브레인 인서트	코닝 코스타	3412
2-O-α-Dglucopyranosyl-L-아스코르브산(비타민 C)	시그마-알드리치	SMB00390-14	연구에는 0.5mM의 농도를 사용해야 합니다.
SH-SY5Y 신경모세포종 세포	증권 시세	SHSY5YATCC CRL-2266
레티노산	시그마-알드리치	SRP3014-10UG	10uM의 최종 농도를 사용해야 합니다
증권 시세	시그마-알드리치	R2625-100MG	2nM의 최종 농도를 사용해야 합니다
디메틸 설폭 사이드 (DMSO)	VWR-알파 에자르	67-68-5	울트라 퓨어 그레이드-멸균 DMSO 사용
Thermo Scientific Nunc 세포 배양 처리된 EasYFlask(T25)	피셔 사이언티픽	제12-565-351
Thermo Scientific Nunc 세포 배양 처리된 EasYFlask(T75)	피셔 사이언티픽	Tel.: 12-565-349

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