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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 슬라이스 준비
- 슬라이스 회수실을 구성하거나 획득합니다.
참고: 회수 챔버의 원리는 간단하며 실험실에서 만들 수 있습니다(그림 1). 간단히 말해서, 이 챔버는 인공 뇌척수액(aCSF)의 표면보다 낮은 수준에서 뇌 절편을 고정하기 위해 바구니가 삽입되는 용기입니다.
- 예를 들어, 4개의 링(높이 4 - 6mm)을 얻습니다(그림 1A, 측면 보기; B, 상단 view) 30cc 주사기를 절단하여 만듭니다. 그런 다음 고리의 한쪽 면에 늘어난 그물(예: 나일론 호스에서 절단)을 붙여서 뇌 절편을 고정하고(그림 1B) 고리를 함께 붙입니다.
참고: 글루건을 사용할 수 있습니다.
- 4개의 고리가 접착되면 곡선형 이등변 사다리꼴 모양의 플라스틱 벽을 두 개의 고리(그림 1A 및 B)에 붙여서 회복 중인 뇌 절편(그림 1C 및 D)에서 산소 기포를 전환합니다. 그림 1D에서 볼 수 있듯이 플라스틱 벽과 같은 쪽에 산소 확산 시스템(여기서는 가스 분산 튜브)을 삽입합니다.
- 슬라이스하기 전에 산소를 공급하고(95% O2/5% CO2) 슬라이싱 용액(1.4 단계 참조)을 0 - 2 °C로 냉각합니다.
- 실온(RT)에서 맞춤형 회수 챔버를 표준 aCSF로 채웁니다. 회수 챔버에 슬라이스를 넣기 전에 aCSF에 산소가 잘 공급되었는지 확인합니다(20 - 30분, 시간은 챔버 부피에 따라 달라질 수 있음). 가스 기포가 슬라이스에 직접 닿거나 방해가 되지 않도록 하십시오.
- 비브라톰 얼음 트레이에 얼음을 깔고 찬물로 채워 슬라이싱 챔버의 1/3에서 1/2이 잠기도록 합니다. 산소 전달 시스템(예: 가스 확산석)과 온도 프로브를 슬라이싱 챔버에 조심스럽게 배치하여 어떤 품목도 블레이드 이동이나 슬라이스 조작을 방해하지 않도록 합니다.
- 뇌를 추출하고 원하는 뇌 영역을 해부하는 데 필요한 해부 영역과 도구를 준비합니다.
참고: 수행되는 정확한 해부는 서로 다른 뇌 구조가 다른 평면(예: 관상상, 시상 또는 수평 절편)에서 절단을 필요로 하기 때문에 연구된 특정 뇌 영역에 따라 달라집니다.
- 참수 가위, 메스, 작고 곧고 날카로운 팁 가위, 혈관 삽관 집게(또는 쥐 두개골에 더 적합한 롱거와 같이 끝이 넓은 수술 도구), 곡선형 지혈 집게, 핀셋, 주걱, 퍼내는 주걱, 여과지, 페트리 접시, 단면 면도날 및 시아노아크릴레이트 접착제.
- 온도가 0-2°C에 도달하면 슬라이싱 용액을 슬라이싱 챔버(버퍼 트레이)로 옮깁니다.
- isoflurane을 사용하여 건조 챔버에서 마우스를 마취합니다. 정확한 양은 사용하는 챔버의 크기에 따라 다를 수 있지만 작은 신발 상자 케이지의 경우 몇 방울 (~ 3-4)을 사용하십시오. 움직일 수 없게 될 때까지 마우스를 케이지에 그대로 둡니다(촉각 자극에 반응하지 않음, 여기에 설명된 조건의 경우 약 15초). 꼬리와 발이 꼬집혀 동물이 완전히 마취되었는지 확인한 다음 심장 박동이 멈추기 전에 목을 베십시오(세포 생존력 향상).
참고: 적절한 정당성을 가지고 일부 실험실에서는 흥분 독성 과정을 최대한 최소화하고 세포 생존력을 향상시키기 위해 생체 참수를 수행할 수 있는 권한을 얻습니다.
- 해부를 수행합니다.
참고: 뇌는 빠르게(<45초) 추출해야 합니다.
- 메스를 사용하여 두개골 위쪽의 표재성 피부를 주부에서 꼬리쪽까지 잘라냅니다.
- 머리 양쪽의 두피를 벗겨냅니다.
- 작고 곧고 날카로운 끝 가위를 사용하여 양봉선 봉합선을 따라 두정엽을 잘라 소뇌를 제거합니다. 후두골을 제거합니다.
- 같은 가위를 사용하여 시상 봉합사를 자릅니다.
- 혈관 캐뉼레이션 겸자(또는 쥐 두개골이 부러진 경우 rongeurs)를 각 두정골 아래로 밀어 넣고 당겨 뇌를 노출시킵니다.
- 구부러진 지혈 겸자를 사용하여 전두골을 꼬집어 부러뜨린 다음 핀셋이나 혈관 캐뉼레이션 겸자를 사용하여 부러진 뼈를 제거합니다. 경막은 박리를 방해할 수 있으므로 가능한 한 부드럽게 절단하고 제거하십시오.
- 주걱을 뇌 아래로 밀어 넣고 두개골에서 부드럽게 빼냅니다. 이전에 얼음처럼 차가운 aCSF로 채워진 슬라이싱 챔버(버퍼 트레이)에 놓습니다. 1-2분 동안 뇌를 식히십시오.
- 표면 접촉을 더 잘 할 수 있도록 페트리 접시에 얼음과 약간의 얼음물을 채워 해부 플랫폼을 준비합니다. 접시를 뚜껑으로 덮고 그 위에 여과지를 놓습니다. 여과지를 차가운 aCSF로 적십니다.
- 뇌가 식으면 얼음이 채워진 페트리 접시에 뇌를 놓고 원하는 슬라이스 평면을 얻기 위해 적절한 해부를 신속하게 수행합니다.
- 측좌핵(NAc)을 포함하는 시상 절편을 얻으려면 단일 모서리 면도날을 사용하여 후각 결절과 소뇌가 아직 존재하는 경우 절단하고 제거합니다. 그런 다음 우반구의 측면 경계에서 2-3mm의 시상 절단을 수행하여 시편 고정 플레이트에 접착될 평평한 표면을 얻습니다(1.8.11단계 참조).
참고: 반구의 측면 경계에서 2 - 3mm만 절단하면 양쪽 반구에서 NAc를 포함하는 슬라이스를 수집할 수 있습니다. 적절한 해부는 조사되는 뇌 영역에 따라 다릅니다. 여기서 NAc 뉴런이 시상 뇌 절편에 기록될 수 있도록 해부가 수행됩니다.
- 원하는 슬라이싱 평면에 따라 뇌의 평평한 절단 표면을 플레이트에 빠르게 접착합니다(시편 고정 플레이트에 적용된 시아노아크릴레이트 접착제 사용). 시상 뇌 슬라이스를 얻으려면 1.8.10단계를 참조하세요.
- 뇌가 꼬리 방향으로 절단되도록 즉시 시편 고정 플레이트를 슬라이싱 챔버에 놓고 고정하십시오(안전을 위해 시편 플레이트가 고정된 경우에만 블레이드 홀더를 설정하십시오).
- 적절한 슬라이싱 매개변수(재료에 언급된 비브라톰에 대해 실험실에서 사용되는 매개변수: 속도 3 - 4, 진동 9-10, 슬라이스 두께 250μm)로 비브라톰을 설정합니다.
- 슬라이스 시 플라스틱으로 트리밍된 전사 피펫을 사용하여 뇌 절편을 회수실(RT에서)로 옮깁니다(1.3단계 참조). 회복 시간은 연구 중인 신경 세포 유형에 따라 달라질 수 있습니다(일반적으로 30 - 90분).
2. 마이크로파이펫 및 리그 준비 기록
- 풀러 사용 설명서의 특정 지침을 참조하여 원하는 마이크로피펫 특성을 얻으십시오.
참고: MSN의 경우 3.2-4.0MΩ의 피펫 저항 범위를 사용합니다.
- aCSF에 산소를 공급하고 유량을 2ml/분으로 조정합니다.연동 펌프 또는 시설에 설치된 진공 라인을 사용하여 aCSF를 진공 청소기로 만듭니다.
- 관류 히터 컨트롤러를 켜고 원하는 온도(예: 31.8-32.2 °C)를 얻기 위해 온도 설정을 조정합니다.
참고: 온도 안정성은 챔버에서 일정한 aCSF 수준과 일정한 유속을 모두 갖는 데 달려 있습니다. 뉴런의 여러 생물물리학적 특성(예: 입력 저항, Ri, 막 저항, Rm이라고도 함)은 온도에 민감하기 때문에 안정적인 온도를 유지하는 것이 중요합니다.
- 컴퓨터 제어 증폭기, 카메라, 미세 조작기 및 현미경 배경 조명을 켭니다. 조직에 대한 전기 자극이 필요한 실험을 수행하는 경우 자극 컨트롤러와 절연 장치를 켜십시오.
알림: 일부 amp다른 제조업체의 liifiers는 사용 전에 "워밍업"을 권장하므로 정확한 작동 절차는 설명서를 참조하는 것이 좋습니다.
- 카메라 캡처, 신호 수집 및 증폭기 소프트웨어를 시작합니다.
- 슬라이스 배치 및 시각화:
- 끝이 잘린 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 회수 챔버에서 하나의 뇌 절편을 부드럽게 끌어냅니다.
- 전사 피펫을 기록 챔버에 놓고 피펫 조각을 챔버 바닥을 감싸고 있는 커버슬립에 부드럽게 짜냅니다.
알림: 오버플로가 발생하지 않는 한 회수 챔버의 일부 aCSF가 수조로 쏟아지는 것은 무해합니다.
- 집게를 사용하여 슬라이스의 위치를 변경하여 원하는 영역이 기록 챔버의 중앙에 정확히 배치되도록 합니다. 현미경 저출력(4X) 대물 렌즈와 접안렌즈를 사용하여 위치 지정을 돕습니다.
- 원하는 위치에 도달한 후 챔버에서 슬라이스 홀드다운("하프"라고도 함)으로 브레인 슬라이스 위치를 고정합니다.
- 고출력(40X) 대물렌즈로 전환하고 챔버의 aCSF와 접촉할 때까지 부드럽게 내립니다.
- 미세 조정 휠을 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다. aCSF와 접촉하는 동안 대물 렌즈를 과도하게 낮추면 슬라이스가 부서지거나 챔버 바닥을 감싸고 있는 커버 슬립이 파손되어 aCSF가 콘덴서에 쏟아져 손상될 수 있으므로 현미경의 거친 조정 휠을 사용하지 마십시오.
- 초점이 조직 수준에 있을 때 대상 영역의 세포에서 모양을 관찰합니다. 죽은 세포는 부풀어 오른 원형질막과 핵으로 쉽게 식별할 수 있습니다(그림 1E). 건강한 세포는 둥글거나 난형이거나 타원형의 균질한 구조로 나타나야 합니다(그림 1E).
- 대상 셀을 찾습니다. 기록 마이크로피펫을 안내하는 데 도움이 되도록 컴퓨터 화면에 표시하십시오. QCapture와 같은 소프트웨어를 사용하는 경우 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 대상 셀 주위에 사각형을 그립니다.
- 대물 렌즈를 들어 올려 대물 렌즈가 aCSF와 접촉하여 형성된 원뿔에 기록 마이크로피펫을 배치하고 이동하기에 충분한 공간이 있도록 합니다.
- 마이크로피펫 배치 및 포지셔닝
- 1ml 주사기, 비금속 마이크로주사기 바늘 및 전용 필터를 사용하여 계획된 실험에 따라 미리 준비된 내부 용액(K+ 기반 또는 Cs+ 기반 내부 용액, 조성 재료 참조)을 마이크로피펫에 채웁니다. 내부 용액이 마이크로피펫 홀더 내의 염화물로 코팅된 은선 전극과 접촉하도록 충분한 용액을 사용하십시오.
알림: 은선 전극은 가정용 표백제에 담그면 염소 처리할 수 있습니다. 뉴클레오시드 삼인산(아데노신 삼인산, ATP & 구아노신 삼인산, GTP)은 사용 전에 내부 용액에 첨가할 수 있습니다. ATP/GTP 분해를 방지하기 위해 용액이 들어있는 주사기를 얼음 위에 보관하십시오.
- 마이크로피펫이 조직에 있는 동안 기포가 나와 슬라이스를 가릴 수 있으므로 마이크로피펫에 기포가 없는지 확인하십시오.
- 마이크로피펫을 전극 홀더에 넣어 용액이 염화은으로 코팅된 와이어 전극과 접촉하도록 합니다.
- 콘 와셔가 마이크로피펫 주위에 밀봉을 형성하도록 피펫 캡을 조입니다.
- 마이크로피펫을 aCSF에 담그기 전에 양압을 가하여 이물질이 파이펫에 유입되는 것을 방지합니다.
- 헤드스테이지를 잠금 위치(챔버를 향함)에 놓고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 챔버 쪽으로 안내하여 침수된 목표물의 중심 아래에 대략
위치하도록 합니다.
- 마이크로매니퓰레이터(중간에서 고속으로 설정)로 마이크로피펫을 이동하는 동안 컴퓨터 화면을 사용하여 마이크로피펫을 찾고 X-Y 축의 세포 위치로 안내합니다.
- 전압 단계(예: 100msec의 경우 4mV)를 적용하여 마이크로피펫 저항을 측정하며, 이는 Clampex 소프트웨어에서 "멤브레인 테스트"를 사용하는 경우 '수조' 모드와 같은 특정 소프트웨어를 통해 수동 또는 자동으로 수행할 수 있습니다(4단계 참조). 기포나 기타 이물질이 마이크로피펫을 막지 않도록 폴리에틸렌 튜브가 있는 마이크로피펫 홀더에 연결된 공기가 채워진 주사기(예: 30cc 주사기)를 사용하여 양압을 가합니다.
- 마이크로피펫을 세척한 후 전압 오프셋을 수행하여 피펫 전류를 0으로 줄이며, 이는 수동으로 또는 컴퓨터 제어 증폭기 커맨더의 '파이펫 오프셋'과 같은 특정 소프트웨어를 통해 수행할 수 있습니다.
알림: 이 기능은 모든 볼륨을 보상합니다.tage 수조와 마이크로피펫 용액 사이의 농도 차이(즉, 액체 접합 전위)로 인해 발생합니다.
3. 멤브레인 테스트
참고: 이 단계는 amp재료에 언급된 liifier.
- 컴퓨터 제어 증폭기를 사용할 때 항상 볼륨으로 설정하십시오.tage-clamp 멤브레인 테스트를 수행하는 모드입니다.
참고: 멤브레인 테스트가 "Bath" 모드로 설정된 경우 멤브레인 테스트를 통해 씰이 형성될 때 마이크로피펫 저항과 밀봉 저항을 측정할 수 있습니다.
- 멤브레인이 파열되면(4.8단계 참조) 멤브레인 테스트를 "셀" 모드로 전환하여 직렬 저항(Ras)(접근 저항,RA라고도 함), R i 및 멤브레인 커패시턴스(CP)를 얻을 수 있습니다.
4. 최종 접근 방식, 밀봉 형성 및 전체 셀 구성 얻기
- 미세 초점 휠을 사용하여 마이크로피펫을 서서히 내리면서 초점을 맞추기 시작합니다. 항상 먼저 초점을 맞춘 다음 마이크로피펫을 초점면까지 내립니다. 이렇게 하면 마이크로피펫 팁이 슬라이스에 갑자기 침투하지 않습니다.
- 마이크로피펫이 슬라이스 표면에 닿으면 마이크로매니퓰레이터 속도를 중간-낮음 모드로 낮춥니다.
- 피펫 홀더에 연결된 공기 주입 주사기로 가벼운 양압을 부드럽게 가하여 접근 경로에서 이물질을 제거합니다.
- X-Y-Z 컨트롤 노브를 번갈아 사용하거나 Z축 노브의 회전에 따라 두 X-Z 축이 모두 변경되는 대각선으로(마이크로 매니퓰레이터 모델이 허용하는 경우) 셀에 접근합니다. 후자의 방법은 조직의 수직 압축을 방지합니다.
참고: 여기서 목표는 슬라이스에 최소한의 손상을 가하여 세포에 접근하는 것입니다. 마이크로피펫이 세포에 충분히 가까우면 딤플(마이크로피펫 끝을 통해 가해지는 양압으로 인해 세포 표면이 둥글게 변색됨)이 나타납니다(그림 2).
- 딤플이 나타나면(그림 2-1) 밀봉을 만들기 위해 피펫 홀더 흡입 튜브에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧게 흡입합니다(그림 2-2). 멤브레인 테스트를 계속 모니터링하십시오.
참고: 부분 씰이 형성된 경우(<1 GΩ) 유지 전위를 낮추어 음전류를 주입하면(컴퓨터 제어 증폭기 커맨더에서) 씰 형성이 촉진되고 기가옴 저항("기가옴 씰" 또는 "기가씰">1 - 5GΩ)에 도달할 수 있습니다. 씰의 높은 저항(>1GΩ)은 기록된 신호에 대한 노이즈 오염을 제한하고 패치의 기계적 안정성에 기여합니다.
- 기가씰이 형성되는 동안 컴퓨터 제어 증폭기 사령관을 사용하여 세포막이 파열된 후 갑작스러운 변화를 방지하기 위해 세포의 유지 전위를 생리적 휴지 전위(V휴식)에 최대한 가깝게 만듭니다. 예를 들어, MSN은 일반적으로 -70 또는 -80 mV(생리학적 V휴식: -70 - -90 mV)에서 전압 클램핑됩니다.
- 기가씰이 형성된 후 수동 또는 자동으로 빠르고 느린 커패시턴스를 보상합니다. Multiclamp 커맨더와 같은 컴퓨터 제어 앰프 커맨더를 사용하는 경우 'Cp Fast' 및 'Cp Slow'에 대해 'Auto'를 누릅니다.
- 씰이 안정적으로 유지되고 1GΩ 이상인 경우(또는 원하는 멤브레인 전위로 세포를 유지하기 위해 10 - 20pA 미만을 주입하는 경우) 4.5에서와 동일한 튜브를 통해 짧고 강한 흡입을 가하여 원형질막을 파열합니다(그림 2-3).
참고: 이 작업은 여러 번의 시도가 필요할 수 있습니다. 파열된 멤브레인이 마이크로피펫을 막지 않을 만큼 충분히 강하게 흡입이 수행되지만(기록 중R-s가 증가할 수 있음) 멤브레인 또는 세포의 많은 부분을 끌어들이지 않을 만큼 충분히 약할 때 양호한 멤브레인 파열이 이루어집니다.
- 성공적인 전체 세포 구성을 달성한 후, 마이크로피펫 위치를 정기적으로 모니터링하여 패치 손실로 이어질 수 있는 상당한 드리프트를 평가하고 수정합니다. 드리프트 진폭은 여러 요인에 따라 달라질 수 있습니다(예: 리그 설치의 품질 및 헤드스테이지의 당기는 힘). 이상적으로는 드리프트가 거의 존재하지 않아야 합니다.
- 멤브레인 테스트에서 "셀" 모드로 전환하면 Ri, Rs 및 Cp와 같은 셀의 다양한 매개변수를 볼 수있습니다. 녹음하는 동안 이러한 매개 변수를 모니터링합니다.
참고: 이러한 모든 매개변수는 세포 및 세포 유형의 초기 건강 상태를 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다(4단계의 "멤브레인 테스트" 섹션 참조).
