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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 솔루션 준비
- 표준 인공 뇌척수액(ACSF; 표 1)
- 고순도 염과 이전에 이중 증류수로 헹군 깨끗한 유리 비커를 사용하여 새로운 용액을 준비하십시오. 모든 세포 외 및 세포 내 용액의 준비를 위해 고품질 이중 증류수를 사용하십시오.
- 표 1에 따르면, 2L 비커를 사용하여 NaHCO3 를 500mL 물에 용해시키고 다른 비커를 사용하여 다른 염을 용해시켜 2가 이온의 침전을 방지한다. 이중 증류수로 주걱을 체계적으로 세척하고 건조시킨 후 소금을 섭취하십시오. 자석 교반기를 사용하여 용해를 균질화합니다. 두 비커의 용액을 적절한 부피 플라스크에 추가하고 적절한 부피로 가져옵니다.
- 최종 세포외 용액이 완전히 투명하고 침전의 흔적이 없는지 확인합니다.
- 슬라이스를 관류하기 20-30분 전에 95% O2 및 5% CO2(탄수화물 가스)와 유리 마이크로 필터 캔들(Ø 13mm)로 구성된 가스 혼합물을 도포합니다. 삼투압계(최적 범위: 314 - 325 mOsmol/L)로 ACSF의 삼투압(2 - 3 연속 측정)을 조심스럽게 제어합니다. 준비 후 남은 용액은 4 °C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오.
- 절단 용액(자당-ACSF; 표 2)
- 3L의 새 용액을 준비합니다. 1L를 사용하여 한 동물의 뇌 조각을 준비합니다. 남은 용액은 4 °C에서 보관하고 3 일 이내에 사용하십시오 .
참고: 높은 Mg2+ 농도와 낮은 Ca2+ 농도는 시냅스 전달을 줄이는 데 사용되며, 일부 NaCl은 조직을 보존하기 위해 자당으로 치환됩니다.
- Intracellular 솔루션
- 이중 전체 세포 기록을 위해 100mL 용액을 미리 준비합니다(표 3).
- 세포 형태의 양호한 회복을 얻기 위해 메틸설페이트를 포함합니다. 바이오사이틴(biocytin, 0.1 - 0.4%)을 첨가하여 뉴런의 형태를 조사합니다. 형광 염료(예: Alexa 594 또는 Sulforhodamine 101 41)를 포함하여 기록 중 수상돌기의 확장을 따릅니다(선택 사항).
- 세포 부착 기록을 위해 100mL 전극 용액을 미리 준비합니다(표 4). 이 경우 내부 용액은 거시적 과분극 활성화 양이온 전류(IH)를 분리하도록 설계된 high-K+ 용액이며 다른 전압 의존성 이온 채널에 대한 차단제를 포함합니다.
- 세포 내 용액을 -20°C에서 2mL 분취액에 보관하고 모든 새로운 기록 세션에 대해 새 분취액을 사용합니다. 삼투압계로 모든 해동된 부분 표본의 삼투압을 주의 깊게 확인하십시오. 삼투압이 초기 값과 일치하지 않는 경우 새 부분 표본을 취합니다.
- 부분 표본의 용액을 3mL 주사기로 옮기고 그 위에 0.22μm 멸균 주사기 필터를 놓습니다. 기록 세션 동안 주사기를 얼음 위에 두어 화합물(ATP, GTP 또는 포스포크레아틴)의 분해를 제한하십시오.
2. 패치 피펫의 제작 및 충전
- 당기
- 수평 전극 풀러와 두꺼운 벽의 붕규산 유리관을 사용하십시오. 전체 세포 및 세포 부착 기록의 경우 2mm 외경/1mm 내경을 사용합니다. 유리관이 절대적으로 깨끗한지 확인하십시오.
- 그렇지 않은 경우 유리 모세관을 먼저 유기 용매(예: 에탄올)에 담근 다음 이중 증류수에 담그십시오. Bunsen 버너로 모세관 끝부분을 짧게 가열합니다. 또는 세척 및 가열된 유리관을 제조업체에서 직접 주문하십시오(재료 목록 참조).
- 이중 체성 수지상 기록의 경우, 세포 내 용액으로 충전될 때 체세포 피펫 저항이 6 - 10 MΩ 사이이고 수지상 피펫의 경우 8 - 19 MΩ 사이인지 확인합니다(표 3). 세포 부착 기록에 대한 피펫 저항을 10MΩ의 저항으로 표준화하여 뉴런의 체성 수지상 도메인을 따라 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.
- 모든 녹음 세션 (매일) 전에 또는 패치 직전에 새로운 피펫을 준비하고 제작 후 5-8 시간 후에 사용하십시오. 피펫을 덮개가 있는 유리 용기에 보관하여 먼지와 팁 방해로부터 보호하십시오.
- 연마
- 모든 피펫 팁을 마이크로포지로 검사하고 열 연마하여 멤브레인으로 더 나은 밀봉을 확보하십시오. 마이크로포지를 사용하기 전에 백금 가열 필라멘트의 작은 유리 조각을 녹입니다. 불변성을 위해 백금 필라멘트의 이 유리 코팅을 매일 교체하십시오(Peter Jonas, 개인 커뮤니케이션).
메모: 셀 부착 기록에 사용되는 피펫은 배경 소음을 줄이기 위해 열 연마 단계 전에 코팅할 수 있습니다. 용융된 치과용 왁스 또는 실리콘 엘라스토머와 같은 절연제를 사용하여 피펫을 코팅할 수 있습니다.
3. Brain Slices의 준비
- 생후 16-19일 사이의 건강한 Wistar 쥐를 사용하십시오. 건강하지 않은 동물이나 저체온증이나 탈수증을 앓고 있는 동물을 사용하지 마십시오. 슬라이스 준비를 시작하기 전에 동물을 안전하고 조용한 장소에 보관하십시오. 동물을 준비하는 동안 방에 다른 동물을 두지 마십시오. 동물을 부드럽게 조종하십시오.
- 2개의 400mL 폴리프로필렌(PP) 비커에 자당-ACSF를 붓고 -80°C 냉동고에 45분 동안 넣습니다. 용액을 혼합하여 균일한 얼음처럼 차가운 액체/냉동 용액을 얻고 비커를 얼음 위에 놓습니다. 각 PP 비커에 있는 마이크로필터 캔들(Ø 13mm)을 사용하여 수크로오스-ACSF 용액에 탄화 가스를 공급합니다.
- 슬라이서와 예비 챔버를 준비합니다
- 수직 진동이 매우 낮은 고품질 조직 슬라이서를 사용하여 슬라이스의 표층의 손상을 최대한 최소화하십시오. 슬라이서에 신선하고 완전한 면도날을 고정하십시오.
- 각 절단 세션에 새 면도날을 사용하십시오. 면도날이 구부러지지 않도록 하십시오. 면도날 표면의 지방 필름을 제거하지 마십시오 (Josef Bischofberger, 개인 커뮤니케이션).
- 가능한 경우 제조업체에서 제공하는 진동 프로브로 수직 진동을 확인하십시오. 또는 맞춤형 진동 프로브를 사용하십시오. 가능한 한 0μm에 가깝게 블레이드의 수직 진동을 줄입니다.
- 슬라이스를 위한 150mL 예비 챔버를 준비합니다. 표준 ACSF를 예비 챔버에 붓고 수조에 넣습니다. 마이크로 필터 캔들(Ø 6mm)을 사용하여 예비 챔버 용액에 탄소를 공급합니다. 카보겐 기포가 가능한 한 작은지 확인하십시오.
메모: 슬라이스 품질을 일정하게 유지하기 위해 2-3개월마다 새로운 예비 챔버를 구축하십시오.
- 슬라이스 잘라
- 실험자가 방해받거나 스트레스를 받지 않는 조용한 방에서 경추 수질 수준에서 수술 가위(길이 150mm)로 동물의 목을 베십시오.
- 메스로 동물의 머리 꼭대기 피부를 코에서 꼬리 방향으로 자르고 옆으로 제거합니다. 가늘게 가위로 꼬리에서 코까지 두개골 윗부분을 자르고 두개골의 두 부분을 옆으로 제거합니다. 얇은 주걱으로 뇌를 제거하고 발암물질과 평형을 이룬 얼음처럼 차가운(0 - 4 °C) 자당-ACSF가 들어 있는 PP 비커에 조심스럽게 떨어뜨립니다.
메모: 이 일련의 단계는 가능한 한 빨리, 그러나 꼼꼼하게(<<1분, 약 40초) 수행해야 합니다.
- PP 비커의 용액에 뇌를 ~2-5분 동안 유지합니다.뇌의 움직임을 방지하기 위해 탄수화물 압력을 조정합니다. 카보겐 기포가 너무 크면 마이크로 필터 캔들을 새 것으로 교체하십시오.
- 내부 바닥이 ~0.5cm 두께의 실가드 층으로 덮인 9cm 페트리 접시에 뇌를 놓습니다. 이 페트리 접시를 미리 준비하십시오.
- 얼음처럼 차가운 자당-ACSF로 뇌를 둘러쌉니다. ACSF-자당 용액의 일부 액상이 뇌를 침수시키는지 확인하십시오. 관상 절편의 경우 메스나 면도날로 관상쇄 평면에서 뇌의 전두엽 부분을 잘라냅니다. 관상동맥 절개로 소뇌를 제거합니다.
- 표본 트레이(면적 ~1cm2)에 시아노아크릴레이트 접착제를 도포합니다. 정면 부분이 슬라이싱 단계를 향하도록 뇌 블록을 붙여넣습니다. 유리 파스퇴르 피펫의 큰 구멍을 사용하여 붙여 넣은 뇌 위에 자당-ACSF를 조심스럽게 떨어 뜨린 다음 슬라이서의 절단 챔버를 천천히 담그십시오. 절단 표면(즉, 칼날에 부딪히는 첫 번째 조직)이 뇌의 복부 표면이 되도록 표본 트레이를 움직입니다.
- 구부러진 유리 마이크로 필터 캔들(Ø 6mm)이 있는 탄소를 절단 챔버(선택 사항)에 도포합니다.
- 면도날을 수평면을 기준으로 ~15° 각도로 조정합니다. 흑질에 도달하기 전에 꼬리에서 코 방향으로 ~500μm의 관상 뇌 절편을 자릅니다. 두께를 줄여 관심 영역을 포함하는 300 - 350 μm 두께의 슬라이스를 자릅니다.
- 면도날 가장자리와 평행한 주사기에 부착된 매우 얇은 관류 바늘로 조직 블록에서 조각을 분리합니다. 바늘과 주사기 사이의 각도가 90°가 되도록 바늘을 구부립니다. 조직 블록에서 슬라이스를 제거하는 동안 면도날에 압력이 가해지지 않도록 하십시오.
- 슬라이스 저장
- 유리 파스퇴르 피펫 (전구에 부착 됨)의 가장 큰 구멍을 사용하여 슬라이스를 예비 챔버로 옮깁니다. 모든 조각이 예비 챔버로 옮겨지면 (Christoph Schmidt-Hieber, 개인 커뮤니케이션) 수조의 온도를 34 ° C로 0.5-1 시간 동안 가져옵니다.
- 이 기간이 지나면 수조의 전원을 끄고 조각을 실온에 보관하십시오. 예비 챔버에서 슬라이스의 움직임을 피하기 위해 탄수화물 압력을 조정하십시오. 녹음을 시작하기 전에 슬라이스를 10-20분 더 보관하십시오.
- 슬라이싱 절차가 끝나면 이중 증류수로 장비와 마이크로 필터 캔들을 조심스럽고 철저하게 청소하십시오.
4. Nigral Neurons 및 Biocytin Filing의 이중 체세포 및 체세포 기록
- Axon Guide에 제공된 슬라이스에 대한 패치 클램프 설정 조립에 대한 설명을 따르십시오.
- 녹음실 준비
- 1 - 2 mL의 이중 증류수를 기록 챔버에 넣습니다. 새지 않는지 확인하십시오. 이동하는 x-y 테이블에 녹음실을 놓습니다.
- 산소 불투과성 관류 튜빙 시스템(폴리테트라플루오로에틸렌)을 통해 표준 ACSF를 기록 챔버에 공급합니다. 챔버 내 관류 흐름을 4 - 5 mL min-1의 속도로 안정화합니다. ACSF가 들어 있는 비커와 기록 챔버를 연결하는 튜브의 길이를 가능한 한 짧게(1m) 유지하십시오.
- 예비 챔버에서 뇌 절편을 선택하고 유리 파스퇴르 피펫의 가장 큰 구멍을 사용하여 기록 챔버로 옮깁니다. 슬라이스를 백금 링으로 덮어 녹음 챔버 바닥에 고정합니다. 평평한 백금 링(Ø 1.5cm)을 사용하고 그 위에 평행 나일론 실(간격 >2mm)을 붙입니다.
- 광학 장치 조정 및 최적화
- 적외선(IR) 비디오 현미경을 사용하여 슬라이스를 시각화합니다. Köhler illumination 51을 조정하고 DIC(differential interference contrast) 광학 장치 또는 oblique 조명(Dodt Gradient contrast - DGC)을 최적화합니다.
- 슬라이스의 품질을 확인하십시오. 너무 강하게 대비되지 않고 작고 분산된 분화구만 있는 매끄럽고 평평한 표면이 있는 조각만 유지하십시오.
- 2개의 신선하고 사용하지 않은 패치 피펫을 세포 내 용액으로 채웁니다(표 3). 피펫 용액이 들어 있는 0.5mL 튜브를 사용하여 모세관 작용으로 피펫 끝을 채웁니다. 필라멘트가 없는 피펫의 팁 충진을 가속화하려면 주사기에 부착된 튜브를 사용하여 피펫 끝에 음의 압력을 가합니다.
- 파이펫을 슬라이스 표면 위에 놓습니다.
- 은선에 염화물 코팅이 되어 있는지 확인하십시오.
- 피펫을 피펫 홀더에 순차적으로 삽입하고 피펫 홀더, 3방향 탭 및 압력계를 연결하는 튜브 회로를 사용하여 양압(~70mbar)을 가합니다. 피펫을 녹음실의 욕조로 내립니다.
- 압력계의 압력 값이 ~1 - 2분 동안 일정한지 확인하십시오. 압력이 감소하면 피펫 홀더 내부의 튜브 또는 밀봉 O-링을 확인하십시오.
- 비디오 모니터 중앙에 피펫 팁을 놓고 막히지 않았는지 확인합니다. 피펫에 압력을 가하거나 해제할 때 피펫 팁이 움직이지 않도록 하십시오.
- 모니터 중앙에서 피펫 팁의 위치에 정확히 작은 십자가를 그려 피펫 팁의 드리프트 및 진동을 확인하고 팁의 가능한 움직임을 5분 동안 관찰합니다.
- 전압 단계(5mV)를 적용하여 오실로스코프의 파이펫 저항을 모니터링합니다. 패치 클램프 증폭기의 유지 전위를 0mV로 설정합니다. DC 파이펫 전류가 증폭기 미터에서 0을 읽도록 파이펫 오프셋 전위를 취소합니다.
- 피펫을 슬라이스로 아래로 이동하고 표면 위에 유지합니다.
- 긴 수상돌기가 있는 뉴런을 선택하고 패치합니다.
- 흑질(substantia nigra) 내에서 IR-Dodt Gradient Contrast(IR-DGC)를 사용하여 거의 동일한 평면(그림 1A 및 1B)에서 장거리를 따라갈 수 있는 긴 수상돌기를 가진 건강한 뉴런을 선택합니다. 매끄럽고 균일한 세포체를 선택하십시오. 슬라이스 표면에서 강하게 대비되는 두 개의 셀(그림 1C 및 1D)은 침입이 어렵고 시간이 지남에 따라 안정적인 기록 조건(안정적인 직렬 저항)을 보존하기 어렵기 때문에 피하십시오. 슬라이스 표면 아래에 10 - 30 μm의 소마가 있는 뉴런을 선택합니다.
- 체세포 전극을 솜털에 가까이(40 - 50 μm 거리)로 옮기고 수지상 전극을 같은 거리에서 수상돌기에 가깝게 움직입니다. 2X 배율(4배 변환기)을 사용하여 수상돌기의 일부를 선택하고 패치합니다. 모니터에서 배율 없이 2,100X(1X)의 절대 배율과 2X 배율로 5,500X의 절대 배율을 얻을 수 있습니다.
- 체세포 피펫의 압력을 10mbar 약간 해제합니다. 필요한 경우, 수지상 및 체세포 피펫 압력을 조절하여 슬라이스 내의 세포 구조(소마 및 수상석)의 변위를 방지합니다.
- 작은 보조개를 볼 수 있도록 수지상 피펫을 멤브레인 가까이에 놓습니다. 피펫 팁에 가해지는 압력을 해제하고 피펫 저항을 제어하면서 수상돌기를 패치합니다. 이상적인 조건에서는 아주 약간의 흡입만으로도 우수한 밀봉을 얻을 수 있습니다.
- 피펫 커패시턴스 과도 현상의 진폭을 전류 단계 위에서 가능한 한 많이 줄이십시오.tage pulse with high gain and little filtering(51)과 오실로스코프를 사용합니다. 수지상 파이펫으로 전체 세포 모드로 들어갑니다.