다전극 배열을 사용한 1차 쥐 나선 신경절 뉴런의 신경 활동 분석

초록

출처: Hahnewald, S., et al. Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 다전극 배열(MEA)에서 1차 쥐 나선 신경절 뉴런(SGN) 배양에서 자발적이고 자극에 의존하는 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 여기에는 MEA를 세척 및 준비하고, 자발적인 신경 활동을 기록하고, 자극에 의존하는 신경 활동을 식별하기 위해 제어된 전기 자극을 적용하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 자발적 및 전극 자극 의존 활성을 조사하기 위한 전기생리학적 기록

1. 다전극 어레이(MEA) 배양액을 실온(RT)에서 세포외 용액으로 세척합니다.
2. 티슈로 접점을 건조시키고 MEA setup.
   에 MEA를 장착합니다. 메모: 장착하는 동안 배양물을 습하게 유지하려면 배양물에 세포외 용액을 소량 떨어뜨립니다.
3. 300μl의 세포외 용액을 추가하고 시스템이 안정화될 때까지 기록하기 전에 10분 동안 기다립니다.
4. 소프트웨어의 기록/획득 버튼을 눌러 모든 전극에서 2분 동안 자발적인 활동을 기록하고 기록 전극을 식별합니다.
5. MEA 전극 자극: 해당 소프트웨어에서 자극의 진폭/지속시간/형상을 선택하고 여러 전극에 연속적으로 적용합니다. 자발적 활성을 보이는 전극을 기준으로 전극을 선택합니다(1.4단계 참조). 나머지 모든 전극에서 기록합니다.
6. 자극 인공물을 배제하려면 동일한 전극에서 10회 자극합니다. 배양액이 10회 중 8회 이상 반응하면 전극 유도 자극에 대한 양성 반응으로 간주할 수 있습니다.
7. 배경 잡음을 식별하려면 테트로도톡신(TTX)을 1μM 농도로 배양물에 적용하여 전위의존성 나트륨 채널을 차단하고 2분 동안 기록합니다. 이를 사용하여 스파이크 감지를 수행합니다(2.1 및 2.2).

2. 데이터 분석

1. 적절한 소프트웨어를 사용하여 표준 편차를 기반으로 하는 검출기와 후속 판별기를 사용하여 각 전극의 자발적인 활동을 감지합니다. 활동은 빠른 전압 과도 상태(<5msec)로 나타납니다.
2. TTX 처리된 샘플을 분석할 때 활동이 없는 임계값을 선택합니다. 각 실험에 대한 임계값을 조정하여 거짓 긍정 탐지와 거짓 부정 탐지를 구별합니다.
3. 적절한 소프트웨어를 사용하여 표준 절차에 따라 각 전극의 감지된 신경 세포 활동을 래스터 플롯으로 관찰합니다(그림 1A-C 참조).
4. 10msec의 슬라이딩 윈도우 내에서 감지된 모든 이벤트를 합산하고 1msec 단계씩 이동하여 총 네트워크 활동을 확인하고 표시합니다.
5. 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 원시 데이터를 표시하여 자극으로 유발된 활동을 감지합니다. 오프라인에서 단일 스파이크를 수동으로 식별합니다. 단일 스파이크는 자극 아티팩트(그림 1E의 화살촉) 이후에 발생하는 빠른 전압 과도 현상으로 나타납니다. 그림 1E에 예제가 나와 있습니다.
6. 실험에 따라 반응하는 전극의 수, 반응을 달성하는 데 필요한 임계값, 전극당 활동 전위 수 및 기타 관심 매개변수를 분석합니다.

결과

그림 1. MEA에 대한 데이터 기록. (A) 자발적인 활동을 보여주는 63개의 전극 중 6개의 원본 기록 흔적. (B) 스파이크 검출 후 그림 1A의 6개 전극에 대한 래스터 플롯. 각 막대는 하나의 활동 전위를 나타냅니다. (C) 모든 전극을 포함하는 래스터 플롯(A 및 B에서와 같이) 63개의 전극(채널 번호 0-63)에서 2분 동안 활성이 기록됩니다.(D) 총 지속 시간이 80μsec이고 진폭이 80μA인 이위상 자극을 사용하여 하나의 전극(그림 2F의 E58)에서 배양을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
세포외 용액(pH 7.4)
염화나트륨			145 밀리미터미터
케이클			4 밀리미터의
재질 보기 MgCl2			1 밀리엠
염화칼슘2			2 밀리엠
헤페스			5 밀리미터미터
나-피루브산			2 밀리엠
포도당			5 밀리미터미터
자료
MEA 전극	콰네 바이오사이언스		(스위스 로잔)
소프트웨어
랩뷰	내쇼날인스트루먼트		스위스
이고프로(IgorPro)	웨이브 메트릭스		레이크 오스웨가, 미국