쥐의 척추 운동 뉴런의 경척추 직류 자극

초록

출처: Bączyk, M., et al. Trans-Spinal Direct Current Stimulation 동안 유형 식별된 쥐 척추 운동 뉴런의 생체 내 기록. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 트랜스 척추 직류 자극 하에서 쥐의 운동 뉴런의 생체 내 녹음을 설명합니다. 이 프로토콜은 막 특성을 측정하고 척수의 항문 또는 음극 분극 전, 도중 및 후에 운동 뉴런의 리드미컬한 발화를 기록하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

참고: 시술에 참여하는 각 참가자는 기본 수술 절차에 대해 적절한 교육을 받아야 하며 동물 실험을 수행할 수 있는 유효한 면허를 소지해야 합니다.

1. 마취 및 투약 전

1. 펜토바르비탈나트륨(체중 400\u2012550g의 6개월 된 수컷 Wistar 쥐의 경우 60mg·^kg-1의 초기 용량)의 복강내 주사로 쥐를 마취합니다.
   메모: 이 프로토콜은 쥐의 표시된 균주, 성별 또는 연령에 국한되지 않습니다. 또한 케타민-자일라진 믹스, 알파-클로랄로스 또는 펜타닐+미다졸람+메데토미딘과 같은 대체 마취제는 다른 연구 목표에 더 적합하거나 윤리 위원회에서 요구하는 경우 사용할 수 있습니다.
2. 약 5분 후 뭉툭한 집게로 쥐의 뒷다리 발가락을 꼬집어 마취 깊이를 확인합니다. 반사 작용이 관찰되지 않는 경우에만 프로토콜의 다음 단계를 진행하십시오.
3. 삽관 후 점액 생성을 줄이기 위해 아트로핀 0.05mL를 피하주사합니다.
4. 4% 포도당 용액, NaHCO3(1%) 및 젤라틴(14%)을 함유한 인산염 완충액 5mL를 피하주사합니다. 이 완충액은 실험 내내 피부 혈관에 흡수되어 체액 균형을 유지하는 데 도움이 됩니다.
5. 수술 내내 주기적으로 동물의 반사 작용을 확인하고 필요한 경우 마취를 보충합니다(펜토바르비탈 나트륨 10mg·^kg-1· ^h-1).

2. 수술

1. 왼쪽 뒷다리의 등쪽 부분, 발목에서 엉덩이, 뒤쪽, 꼬리에서 높은 흉부(Th) 분절까지, 가슴의 왼쪽, 흉골 위의 목 부분의 복부 쪽의 털을 면도하여 외과 치료를 받을 수 있도록 동물을 준비합니다
2. 정맥 주사 라인의 배치
   1. 쥐를 폐쇄 루프 가열 패드에 등을 대고 놓습니다(그리고 팔다리 고정 장치로 고정).
   2. 21개의 날을 사용하여 흉골에서 턱까지 피부를 세로로 자릅니다.
   3. 집게로 피부를 잡고 아래 조직과 분리합니다.
   4. 둔기 해부 기술을 사용하여 올바른 경정맥을 노출시킵니다. 주변 조직에서 정맥을 조심스럽게 절개합니다.
   5. 분기점이 없는 정맥 부분을 찾아 그 아래에 두 개의 4-0 합자를 밀어 넣습니다.
   6. 이전에 확인된 정맥의 분지하지 않은 분절의 근위 끝에 느슨한 매듭 하나를 만들고 정맥의 이 분절의 원위 끝에 느슨한 매듭 하나를 만듭니다. 심장 근위부의 정맥을 고정한 다음 정맥의 원위 부분을 결찰합니다.
   7. 홍채 가위를 사용하여 클램프와 먼 거리의 합자 사이를 절개합니다. 정맥의 플랩을 잡고 클램프로 막힌 지점까지 미리 채워진 카테터를 삽입합니다.
   8. 정맥과 카테터를 겸자로 함께 잡고 클램프를 제거하고 카테터를 정맥 안으로 몇 밀리미터 밀어 넣습니다. 카테터의 양쪽 끝을 정맥에 고정하고 피부에 고정 지점을 추가합니다.

3. 기관관 소개

1. 뭉툭한 집게를 사용하여 흉골 근육을 덮고 있는 두 개의 하악선을 분리합니다. 기관을 노출시키기 위해 정중선에서 흉골 근육을 분리합니다.
2. 기관 아래에 3개의 4-0 합자를 밀어 넣은 다음 기관 튜브 삽입 지점 아래에 두 개의 매듭을 만들고 위에 한 개의 매듭을 만듭니다.
3. 후두의 십자형 연골을 찾아 세 번째 기관 연골 아래를 절개합니다.
4. 기관 아래로 기관 튜브를 삽입하고 미리 준비된 합자로 튜브를 제자리에 고정한 다음 피부에 추가 합자를 추가합니다.
5. 분리된 근육 위에 작은 면봉 조각을 놓고 수술 부위에 피부를 봉합합니다.

4. 뒷다리 신경 절제

1. 21 블레이드를 사용하여 아킬레스건에서 엉덩이까지 왼쪽 뒷다리의 뒤쪽을 세로로 자릅니다.
2. 집게로 피부를 잡고 둔기 해부 기술을 사용하여 절개 부위 양쪽의 기저 근육에서 피부를 분리합니다.
3. 대퇴이두근으로 덮여 있는 무릎 관절 뒤쪽의 슬와골을 찾아 가위를 사용하여 이 근육의 전방과 후방을 절단합니다.
4. 위쪽으로 이동하여 대퇴 이두박근의 두 머리를 엉덩이까지 잘라 좌골 신경을 노출시킵니다. 출혈을 방지하기 위해 필요에 따라 소작하십시오.
5. 좌골 신경의 sural, tibial 및 common peroneal branches를 확인합니다.
6. 가위를 사용하여 비복근의 외측과 내측을 분리하여 경골 신경과 그 가지를 노출시킵니다.
7. 55개의 집게를 사용하여 구신경의 말단부를 잡고 원위부로 절단한 다음 가능한 한 멀리 절개합니다.
8. 총비골 신경으로 절차를 반복합니다.
9. 뭉툭한 유리 막대를 사용하여 경골 신경을 주변 조직과 분리하고 혈관이 손상되지 않도록 주의하며 원위부로 절단합니다.
10. 내측 비복근(MG)과 외측 비복근 및 가자미근(LGS) 신경을 확인합니다.
11. 55개의 겸자를 사용하여 MG 및 LGS 신경을 조심스럽게 해부하여 주변 조직과 분리하되 각 근육과의 연결을 유지합니다.
12. 노출된 신경 아래에 식염수에 적신 면모 조각을 놓습니다.
13. 수술 부위의 피부를 닫습니다.

5. 후판 절제술

1. 21 블레이드를 사용하여 천골에서 흉추까지 세로로 절개합니다.
2. 피부와 기저 근육을 분리한다.
3. 흉추 및 요추 돌기의 양쪽에 있는 종근을 절단합니다.
4. 뭉툭한 메스를 사용하여 척추에서 근육을 수축시켜 각 척추의 횡돌기를 드러냅니다.
5. 뭉툭한 가위를 사용하여 노출된 척추를 따라 횡돌기에 연결된 근육의 힘줄을 자릅니다. 필요한 경우 지혈제를 바르십시오.
6. Th13 척추를 갈비뼈가 삽입된 가장 낮은 흉부 분절로 확인하고, 미세한 롱거를 사용하여 Th13에서 L2 척추까지 가시돌기와 층을 제거하여 척수의 요추 분절을 노출시킵니다. 척추 안정화를 위한 고정 지점으로 사용되는 L3 가시돌기를 손상시키지 마십시오.
7. Th12 가시돌기를 제거하고 척추 등쪽 표면을 최대한 매끄럽게 합니다.
8. 둔기 해부 기술을 사용하여 Th11 척추에서 근육을 분리하여 홀더 삽입 지점을 만듭니다.
9. 노출된 척수 부분 위에 식염수에 적신 얇은 면모를 놓습니다.
10. 척추를 지지하고 안정시키기 위해 두 개의 평행 막대와 클램프가 있는 두 개의 조정 가능한 팔이 있는 맞춤형 금속 프레임으로 쥐를 이동합니다.

6. 녹음 및 자극 준비

1. 척추 고정 및 신경 배열
2. 동물의 체온을 37 ± 1°C로 유지하기 위해 폐쇄 루프 난방 시스템에 연결된 가열 패드에 맞춤형 프레임에 쥐를 놓습니다.
3. 피부 아래에 심전도(ECG) 전극을 삽입하고 심박수 모니터링을 위해 증폭기에 연결합니다.
4. 피부 피판을 사용하여 노출된 척수 위에 깊은 웅덩이를 형성합니다.
5. 금속 클램프를 사용하여 Th12 횡돌기 아래와 L3 가시돌기 아래에 클램프를 넣어 척추를 고정합니다.
6. 척추가 고정되고 수평으로 배열되어 있는지 확인한 다음 기둥 양쪽에 배-복부 압력을 가하여 근육을 수축시킵니다.
7. 수영장에 따뜻한(37°C) 미네랄 오일을 채우고 이 온도로 유지하십시오.
8. 아킬레스건에 4-0 결찰을 끼우고, 수술한 왼쪽 뒷다리를 들어 올려 스트레칭하여 발목이 엉덩이와 수평이 되도록 합니다.
9. 피부 플랩을 사용하여 노출된 경골, MG 및 LGS 신경에 깊은 웅덩이를 만듭니다.
10. 수영장에 따뜻한(37°C) 미네랄 오일을 채웁니다.
11. MG 및 LGS 신경을 양극성 은선 자극 전극에 놓고 사각형 펄스 자극기에 연결합니다. 각 신경에 대해 별도의 자극 채널을 사용하십시오.

7. 표면 전극 배치

1. 등 근육에 기준 전극을 삽입한 상태에서 노출된 척수의 왼쪽 꼬리 쪽에 은색 공 전극을 놓고 두 전극을 차동 DC 증폭기에 연결합니다. 표면 볼 전극은 신경의 구심성 발리를 기록하는 데 사용됩니다.
2. 정전류 자극기를 사용하여 3Hz의 주파수로 반복되는 0.1ms 지속 시간의 사각 펄스로 MG 및 LGS 신경을 자극하고 구심성 일제 사격을 관찰합니다.
3. 신경 활성화에 대한 역치(T)를 결정하고, 약 3·T 강도로 각 신경을 자극하고, 각 신경에 대한 구심성 발리의 진폭을 기록합니다.
4. 표면 전극 주부를 이동하고 절차를 반복하여 각 신경에 대해 발리의 진폭이 가장 높은 척추 분절을 식별합니다. 최대 발리 위치를 결정한 후 표면 전극을 척수에서 안전한 거리로 이동합니다.
5. 근육 마비와 기흉을 형성하여 호흡 운동을 줄이기 위해
6. 신경근 차단제로 쥐를 정맥 마비시키고 설치류와 호환되는 카프노미터(판쿠로늄 브로마이드, 초기 용량 0.4 mg·^kg-1, 30분마다 0.2 mg·^kg-1 용량으로 보충)와 함께 기관 튜브를 외부 인공호흡기에 연결합니다.
7. 호기말 CO₂ 농도를 모니터링하고 환기 매개변수(빈도, 기압 및 유량)를 조정하여 약 3\u20124%로 유지합니다.
8. 녹음 측면의 5번째와 6번째 갈비뼈 사이의 피부를 세로로 절개합니다.
9. 뭉툭한 가위를 사용하여 위에 있는 근육을 잘라 갈비뼈 사이의 늑간 공간을 시각화합니다.
10. 작고 날카로운 가위를 사용하여 늑간 근육과 흉막을 작게 절개 한 다음 폐를 누르지 않도록주의하면서 뭉툭한 집게의 끝을 구멍에 삽입하십시오.
11. 집게가 팽창하거나 작은 튜브를 삽입하여 실험 내내 기흉을 열어 두십시오.
12. 신경근 차단 후 ECG 빈도를 확인하여 마취 깊이를 모니터링하고 심박수가 400bpm을 초과하면 마취제를 보충합니다. 근육 마비 및 기흉을 형성하여 호흡 움직임을 줄여 기록 안정성을 향상시킵니다.

8. 경막과 피아 재료 열기

1. #55 겸자를 사용하여 경막을 부드럽게 들어 올리고 L5 분절에서 꼬리 방향으로 L4 분절까지 자릅니다.
2. 한 쌍의 초박형 5SF 겸자를 사용하여 MG 또는 LGS 신경의 최대 구심성 일제 사격 수준에서 혈관 사이의 등쪽 기둥을 덮고 있는 피아에 작은 패치를 만듭니다.
3. 필요한 경우 식염수에 담그고 건조시킨 작은 젤 폼 조각을 사용하여 출혈을 차단합니다.

9. 척추 간 직류 자극 (tsDCS) 전극 배치

1. 요추 (L)4-L5 척추 분절의 위치에 해당하는 꼬리 높이에서 쥐 복부의 복부 쪽 피부를 작게 절개합니다.
2. 기준 전극 역할을 하는 금속 클립으로 노출된 피부 덮개를 잡습니다.
3. 식염수에 적신 스펀지를 흉추 (Th) 12 척추의 등쪽에 놓습니다. 스폰지 크기가 활성 tsDCS 전극(직경 5mm의 원형 스테인리스 강판)의 크기와 같은지 확인하십시오.
4. 미세 매니퓰레이터를 사용하여 활성 tsDCS 전극이 있는 스펀지를 뼈에 누르고 전극의 전체 표면이 동일하게 눌러졌는지 확인합니다.
5. 레퍼런스 및 액티브 tsDCS 전극을 직류의 연속적인 흐름을 전달할 수 있는 정전류 자극기 장치에 연결합니다.

10. 마이크로 피펫 준비

1. 미세 전극 풀러를 사용하여 미세 전극을 준비합니다.
   메모: 필라멘트 전극과 비필라멘트 전극을 모두 사용할 수 있습니다. 그러나 전극의 생크는 복부 뿔에 도달할 수 있을 만큼 충분히 길어야 하며 하강하는 동안 척수를 압박하지 않을 만큼 얇아야 한다는 점을 기억하십시오.
2. 척수로 들어가는 생크의 길이가 약 3mm, 전극 끝의 직경이 1-2012μm 이하, 미세 전극 저항이 10에서 20MΩ 사이가 되도록 풀러 설정을 조정합니다.
3. 미세 전극을 2M 구연산칼륨 전해질로 채웁니다.
4. 준비된 미세전극을 마이크로매니퓰레이터에 장착하여 1\u20122μm 스테핑 이동과 입체식 보정을 허용합니다.
5. 미세 전극을 세포 내 증폭기에 연결하고 기준 전극을 등 근육에 배치합니다.
6. 신경근 차단 후 심전도(ECG) 빈도를 확인하여 마취 깊이를 모니터링하고 쥐의 심박수가 400bpm을 초과하지 않도록 마취제를 보충합니다.

11. Motoneuron 추적 및 침투

1. 구심성 발리 기록 전극을 척수의 등쪽 표면에 다시 놓고 꼬리 방향으로 기록 부위의 위치로 L6 분절 수준으로 놓습니다.
2. 내측 비복근(MG)과 외측 비복근 및 가자미선(LGS) 신경을 3Hz 및 3T 강도의 주파수에서 전기 0.1ms 펄스로 자극하여 선택한 신경 내에서 알파 운동 뉴런의 모든 축삭을 활성화합니다.
3. 마이크로피펫을 15\u201220°의 중간 각도로 pia의 선택한 패치로 밀어 넣습니다(팁이 측면으로 향함).
4. 표면 아래로 내려간 후 미세 전극을 보정하고 커패시턴스 및 전압 오프셋을 보상하고 모든 매개변수가 안정적일 때 척수 침투를 계속합니다. motoneuron pool의 antidromic field potential은 각 신경을 자극하는 동안 전용 운동 핵에 접근하는 동안 미세 전극 전압 트레이스에서 볼 수 있습니다.
5. 1\u20122 μm 단위로 미세 전극으로 침투를 진행하고 주기적으로 세포 내 증폭기의 버즈 기능을 사용하여 전극 팁에 잔류물이 남아 있는지 제거합니다.
6. 기록된 전압 트레이스의 갑작스러운 과분극과 항드로믹 스파이크 전위의 출현을 특징으로 하는 모토뉴런 침투를 관찰합니다.

12. 운동 뉴런 막 및 발화 특성 기록

1. 세포 내 증폭기의 브리지 모드에서, 각 신경 가지를 자극하여 항드로믹 활동 전위의 "전부 아니면 전무" 모양을 기반으로 모토뉴런을 식별합니다. 나중에 평균화할 수 있도록 20개의 후속 추적을 기록합니다.
2. 고품질 데이터를 보장하기 위해 엄격한 포함 기준을 구현합니다: 진폭이 최소 -50mV인 휴지 멤브레인 전위; 포지티브 오버슈트가 있는 50mV보다 큰 활동 전위 진폭; 기록 전 최소 5분 동안 안정적인 멤브레인 전위.
3. 세포 내 증폭기의 불연속 전류 클램프 모드(전류 스위치 속도 모드 4–8kHz)에서 0.5ms 세포 내 탈분극 전류 펄스를 사용하여 모터 뉴런에서 직교 활동 전위를 유발합니다. 오프라인 평균을 위해 20회 이상 반복합니다.
4. 세포 입력 저항을 계산하기 위해 40개의 짧은 펄스(100ms)의 과분극 전류(1nA)로 모토뉴런을 자극합니다.
5. 증가하는 진폭에서 50ms 구형파 펄스로 모토뉴런을 자극하여 단일 스파이크를 유도하는 데 필요한 탈분극 전류의 최소 진폭으로 유변염기 값을 결정합니다.
6. 0.1-2nA 단위로 증가하는 진폭에서 탈분극 전류의 500ms 구형파 펄스를 주입하여 운동 뉴런의 리드미컬한 방전을 유발합니다.

13. 척추 직류 자극 (tsDCS)

1. 운동 뉴런의 안정적인 침투를 유지하면서 직류의 척추 횡단 적용으로 분극 절차를 시작합니다. 실험 설계에 대한 전류 강도와 적용 시간을 조정합니다(예: 15분 동안 0.1mA).
2. DC를 켠 직후 모터 뉴런 막 전위를 관찰하십시오. 양극 분극(양극으로서의 활성 전극)은 막 전위의 탈분극을 초래해야 하는 반면, 음극 분극(음극으로서의 활성 전극)은 반대 효과를 유발해야 합니다. DC 자극에 대한 반응으로 휴지막 전위의 변화가 일정한지 관찰하여 전기장 강도가 영향을 받지 않는지 확인합니다.
3. 연속 전류 적용 중에는 5.3\u20125.6단계를 5분 간격으로 반복합니다.
4. DC를 끄고 녹음이 불안정해지거나 포함 기준이 손상될 때까지 5분 간격으로 5.3\u20125.6단계를 계속 반복합니다.
5. 실험을 종료하고 치사량의 펜토바르비탈 나트륨(180 mg·^kg-1)을 정맥 주사하여 동물을 안락사시킨다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Durgs 및 솔루션	-	-	-
아트로피눔 설퍼리쿰	폴파 바르샤바	-	-
포도당	머 크	346351	-
나HCO3	머 크	106329	-
판쿠로늄 옐파	파마스위스/발레언트	-	신경근 차단제
펜토바르비탈 나트륨	Biowet Puawy Sp. z oo	-	주요 마취제
구연산 칼륨	쳄푸르	6100년 5월 6	-
테트라스판	브라운	-	HES 솔루션
수술 장비	-	-	-
21 블레이드	증권 시세	10021-00	메스 칼날
소작	증권 시세	18010-00	-
흉관	밀라	CT1215	-
Dumont #4 집게	증권 시세	11241-30	근육 겸
Dumont #5 집게	증권 시세	11254-20	듀라 겸자
Dumont #5F 집게	증권 시세	11255-20	신경 겸자
Dumont #5SF 집게	증권 시세	11252-00	피아 겸자
집게	증권 시세	11008-13	무딘 집게
집게	증권 시세	11053-10	피부겸자
헤모스탯	증권 시세	13013-14	-
롱거	증권 시세	16021-14	후판 절제술의 경우
가위	증권 시세	15000-08	정맥 가위
가위	증권 시세	15002-08	듀라 가위
가위	증권 시세	14184-09	기관 절단용
가위	증권 시세	제104075-11	근육 가위
가위	증권 시세	14002-13	피부 가위
기관 튜브	-	-	맞춤 제작
정맥 카테터	비곤	1261년 201	-
혈관 캐뉼레이션 겸자	증권 시세	18403-11	-
용기 클램프	증권 시세	18320-11	정맥 클램핑용
혈관 팽창 프로브	증권 시세	10160-13	정맥 박리용
Sugrgical 재료	-	-	-
젤 폼	화 이자	GTIN 00300090315085	지혈제
실크 봉합사 4.0	증권 시세	18020-40	-
실크 봉합사 6.0	증권 시세	18020-60	-
설비	-	-	-
액소클램프 2B	분자 장치	중단	세포내 증폭기/ 신모델 Axoclamp 900A
CapStar-100 호기말 CO2 모니터	증권 시세	11-10000	가스 분석기
잔디 S-88	A-M 시스템	중단	정전류 자극기
유연한 프로브를 사용한 Homeothermic Blanket Systems	하버드 기구	507222F	난방 시스템
ISO-댐8A	WPI (영어)	74020	세포외 증폭기
마이크로드라이브	-	-	맞춤 제작/교체 IVM/Scientifica
P-1000 미세 전극 풀러	셔터 기기	P-1000	미세 전극 풀러
SAR-830/AP 소형 동물 인공호흡기	증권 시세	제12-02100	호흡기
지지 프레임	-	-	맞춤 제작/교체 실험실 표준 베이스 51601/스톨팅
척추 클램프	-	-	맞춤 제작/교체용 쥐 척추 어댑터 51695/Stoelting
TP-1 DC 자극기	위누에	-	tsDCS 자극기
잡다한	-	-	-
1B150-4 유리 모세관	WPI (영어)	AN-번호 1B150-4	미세전극 생산용
목화	-	-	-
유연한 튜빙	-	-	호흡기 및 CO2 분석기 연결용
마이크로필	WPI (영어)	MF28G67-5	마이크로피펫 주입용
은선	-	-	신경 전극용

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