Whole-Cell Patch-Clamp 기술을 사용하여 내측 전정핵 뉴런에 잡음 전류 적용

초록

출처: Stefani, S. P., et al. 체외 내측 전정핵 뉴런 민감도 평가를 위한 확률적 노이즈 애플리케이션. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 전기 자극에 대한 뉴런 민감도에 대한 노이즈 전류의 영향을 연구하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 내측 전정 핵 뉴런에 하위 임계값 노이즈 전류를 적용하는 것과 관련된 프로토콜을 보여줍니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 동물

참고: 생쥐는 호주 설치류 센터(ARC; 호주 퍼스)에서 개최되었으며 시드니 대학의 의료 재단 건물 동물 시설에서 개최되었습니다.

1. 환경 강화와 함께 표준 12시간 명암 주기로 마우스를 유지합니다.
2. 모든 실험에 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스(3-5주령)를 사용합니다.

2. 솔루션 준비

1. 29 mM NaHCO₃, 11 mM 포도당, 120 mM NaCl, 3.3 mM KCl, 1.4 mM NaH₂PO₄, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl₂로 구성된 인공 뇌척수액(ACSF) 1 L를 준비합니다.
2. 29 mM NaHCO3, 11 mM 포도당, 241.5 mM 슈크로스, 3.3 mM KCl, 1.4 mM _NaH2PO4, 2.2 mM MgCl₂, 2.77 mM CaCl2를 함유하는 200 mL의 슈크로스-ACSF(sACSF)를 준비한다. ACSF 및 sACSF에 CaCl₂를 첨가하기 전에 용액에 탄소(95%_O2 및 5% CO₂)를 가스화하여 pH 7.4를 설정하고 칼슘 침전(탁함)을 방지합니다.
3. 70mM 글루콘산칼륨, 70mM KCl, 2mM NaCl, 10mM HEPES, 4mM EGTA, 4mM Mg_2-ATP, 0.3mM Na_3-GTP로 구성된 K⁺ 기반 세포 내 용액을 준비하며 최종 pH는 7.3(KOH를 사용하여 조정)입니다.
   메모: 세포 내 용액은 0.22μm 필터로 여과하고 -20°C에서 0.5mL 분취량에 보관하는 것이 좋습니다.

3. 뇌간의 준비

1. 뇌간 추출 전에 sACSF를 탄소로 평형을 이루고 -80°C에서 25분 동안 냉각하여 얼음 슬러리를 형성합니다.
2. 산소(3mL/분)에 포화된 이소플루란(3–5%)으로 마우스를 마취합니다. 뒷발 반사 신경이 사라지면 날카로운 스테인리스 스틸 가위로 쥐의 목을 베십시오.
3. 면도날(#22 둥근)을 사용하여 피부를 시상절개하여 두개골을 노출시킵니다.
4. 한 쌍의 표준 패턴 가위의 뾰족한 끝을 사용하여 람다를 작게 절개하고 세로 균열을 따라 자릅니다.
5. 한 쌍의 얕은 구부러진 Pearson rongeurs를 사용하여 한 쌍의 두정골과 후두골을 조심스럽게 반사합니다.
   메모: 이 과정에서 뇌는 미리 준비된 얼음처럼 차가운 sACSF 슬러리를 사용하여 지속적으로 현장에서 목욕을 합니다.
6. 면도날(#11 straight)을 사용하여 두정-후두열구와 꼬리 수질에서 뇌간을 분리
하고 뼈를 감싸고 있습니다.
7. 고립된 뇌간 복부 끝을 이전에 절단된 사다리꼴 폴리스티렌 블록에 장착합니다. 티슈 페이퍼 심지를 사용하여 절개된 조직 주변의 과도한 액체를 제거하고 절단 단계에 대한 조직 접착력이 양호한지 확인하십시오.
   메모: 폴리스티렌 블록은 중뇌의 상부 끝이 척수에 맞고 가늘어지도록 사다리꼴 모양으로 절단됩니다.
8. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌간 끝이 부착된 폴리스티렌 블록을 절단 단계까지 고정합니다.
9. 0.16mm/s의 고급 속도와 3.00mm의 진동 진폭을 사용하여 MVN.
   의 200μm 가로 슬라이스를 준비합니다. 메모: MVN의 위치는 Paxinos 및 Franklin 마우스 뇌 지도(Paxinos and Franklin mouse brain atlas)를 사용하여 결정됩니다. MVN(아틀라스에서 MVe로 나열됨)은 제4심실의 바로 복측에 위치하며 소뇌(inferior colliculi와 obex 사이)가 부착되기 직전에 가장 큽니다.
10. 플라스틱으로 자른 피펫을 사용하여 25°C의 발암 ACSF에 보관된 여과지 디스크로 슬라이스를 옮기는 데 최소 30분 동안 기록하십시오.

4. 악기

1. 표준 전기생리학적 설정을 사용하여 전체 세포 패치 클램프 기술을 수행합니다.
2. 마이크로피펫 풀러에서 2단계 프로토콜(가열 단계 1: 70, 가열 단계 2: 45)을 사용하여 마이크로피펫을 준비합니다(재료 표 참조).
3. 수조에 넣었을 때 마이크로피펫은 내부 용액과 함께 3 - 5MΩ 범위의 최종 저항을 가져야 합니다.
   메모: 사용되는 설정은 실내 온도에 따라 달라질 수 있으며 매우 자주 변경될 수 있습니다.

5. 전체 세포 패치 클램프 전기생리학

1. MVN의 개별 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 얻기 위해 기록 피펫 내에서 K+ 기반 내부 솔루션이 사용됩니다.
2. 배양 챔버에서 단일 조직 조각을 기록 챔버로 옮기고 U자형 추에 나일론 실을 사용하여 고정합니다. 25°C에서 3mL/분 유속으로 발암-ACSF로 기록 챔버를 지속적으로 관류합니다.
3. 마이크로피펫에 내부 용액을 채운 후 저전력(10x) 대물렌즈를 사용하여 MVN을 찾습니다. 고출력(40x) 대물렌즈를 사용하여 MVN 내의 개별 뉴런을 찾을 수 있습니다.
   메모: 셀 품질은 전체 셀 구성을 달성하려고 시도할 때 셀의 품질 기록과 내구성을 보장하는 데 필수적입니다. 적합한 세포는 구형, 반사 세포막 및 보이지 않는 핵을 나타냅니다. 부적합한 세포는 눈에 보이는 큰 핵(달걀 모양)과 부풀어 오르거나 쭈글쭈글한 모양을 가지고 있습니다.
4. 피펫으로 조직을 절단하기 전에 소량의 양압을 가하여 피펫 팁에서 파편을 밀어냅니다.
5. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 피펫을 선택한 뉴런 쪽으로 움직이면 뉴런 막에 작은 딤플이 형성되어야 합니다.
   양압을 해제하고 소량의 음압을 가하십시오.
6. 1GΩ 밀봉이 완료되면 흡입 포트를 통해 피펫 홀더에 부드럽고 짧고 날카로운 음압을 가하여 멤브레인을 파열하고 전체 셀 구성을 만듭니다.
7. 표준 기술을 사용하여 전체 셀 전류 클램프 기록을 만들 수 있습니다.

6. 개별 내측 전정 핵 뉴런에 정현파 및 확률 잡음 적용

1. 3pA에서 24pA까지의 진폭 범위에서 확률적 및 정현파 노이즈를 적용하여 뉴런 임계값과 발화 속도를 결정합니다.
2. 더 낮은 자극 강도와 높은 자극 강도를 그룹화하여 감각 역치를 결정하고 ANOVA를 수행하여 차이를 관찰합니다(그림 1 참조).
3. 각 개별 전류 레벨에 대해 탈분극 전류 단계가 주입되거나 주입될 10초 동안의 평균 발사 속도를 계산합니다(즉, 총 7개의 에피소드; 그림 2).
4. 평균 발사 속도 값을 사용하여 현재 플롯에 대한 발사 속도를 생성하고 선형 회귀 분석을 수행하여 최적 선의 기울기를 결정합니다. 최적선의 기울기는 뉴런 이득을 나타냅니다.

결과

그림 1: 12pA 임계값의 객관적 측정. 12 pA 미만(3 및 6 pA) 및 12 pA(18 및 24 pA) 이상에 대한 발사 속도를 합산하고 평균화했습니다. 그런 다음 이러한 평균은 ANOVA와 가짜와 >12 pA 사이 및 <12 pA와 >12 pA 사이의 통계적 유의성을 사용하여 분석되었습니다. *P < 0.05.

그림 2: 제어, 정현파 및 확률적 잡음 프로토콜의 다이어그램 프로파일.(A) MVN 뉴런에 적용되는 제어(노이즈 없음)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화칼슘2	샬라우	CA01951000	ACSF 및 sACSF에 사용
D-(+)-포도당	시그마	G8270	ACSF 및 sACSF에 사용
에그타	시그마	E0396-25G	K 기반 세포내 용액에 사용
헤페스	시그마	H3375-25G	K 기반 세포내 용액에 사용
케이클	화학 공급	PA054-500G	ACSF, sACSF 및 세포 내 솔루션에 사용
K-글루코네이트	시그마	P1847-100지	K 기반 세포내 용액에 사용
마그네슘-ATP	시그마	A9187-500MG	K 기반 세포내 용액에 사용
마그네슘Cl	화학 공급	MA00360500	ACSF 및 sACSF에 사용
나3-GTP	시그마	G8877-100MG	K 기반 세포내 용액에 사용
염화나트륨	화학 공급	SO02270500	ACSF 및 세포 내 솔루션에 사용
NaH2PO4.2H 2O	아약스	아자471-500G	ACSF 및 sACSF에 사용
나HCO3	시그마	S5761-1KG	ACSF 및 sACSF에 사용
자당	화학 공급	SA030-500지	sACSF에 사용
이소플루란	헨리 샤인	1169567762	마우스 마취에 사용
설비
붕규산 유리 모세관	워너 악기	GC150T-7.5	1.5mm OD, 1.16mm ID, 7.5cm 길이
데이터 수집 소프트웨어	액소그래프		전기생리학 및 분석에 사용
프리드먼-피어슨 롱거스	세계적인 정밀 기기	14089	해부에 사용
마이크로피펫 풀러	나리시게	증권 시세 표시기 - 830	마이크로피펫에 사용
멀티 클램프 증폭기	축삭 기기	700비	전기생리학에 사용
pH 측정기	Sper 사이언티픽	860033	내부 솔루션에 사용
표준 패턴 가위	증권 시세	14028-10	해부에 사용
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정립 현미경	올림푸스	BX51WI	전기생리학에 사용
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