Detecting Hydrogen Peroxide Levels in Cultured Neurons Through Live-Cell Fluorescence Imaging

초록

출처: Terzi, A. et al., ROS 신경 발달 중 라이브 셀 이미징.J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 roGFP2-Orp1 바이오센서 및 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 망막 신경절 세포에서 실시간 과산화수소 수치를 감지하는 기술을 보여줍니다. 세포 준비, 형광 이미징 및 과산화수소 수치의 정량화와 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. 배양된 망막 신경절 세포(RGC) 뉴런의 체외 반응 산소 종(ROS) 이미징

1. 이미징 당일(일반적으로 세포 도금 후 6-24시간)에 망막 신경절 세포를 현미경으로 검사하여 망막 신경절 세포의 성장을 확인합니다.
2. 라이브 셀 이미징의 경우, 배양 접시에서 라이브 셀 이미징 챔버로 커버슬립을 옮깁니다.
3. 이미징을 위한 현미경을 설정합니다. 미분 간섭 대비(DIC) 대물렌즈, OG590 장역 통과 적색 필터 및 EM-CCD 카메라가 장착된 도립 현미경을 사용합니다.
4. 이미징하기 전에 혈청 및 항생제가 포함된 제브라피쉬 세포 배양 배지(ZFCM(+))를 혈청 및 항생제가 없는 제브라피쉬 세포 배양 배지(ZFCM(-))로 교체합니다.
5. 10x 대물렌즈로 세포를 배치하면 높은 NA 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 60x 배율로 이미지를 획득합니다. 추가로 1.5배 확대를 사용합니다.
6. 먼저 DIC 이미지를 획득합니다. 그런 다음 적절한 필터 세트를 사용하여 roGFP2-Orp1을 이미지화합니다. 405/20 및 480/30 nm excitation filter로 roGFP2-Orp1을 순차적으로 excite 하고 방출광이 dichroic mirror 505DCXR을 통과한 후 535/30 nm emission filter로 이미지를 획득합니다.
7. 첫 번째 이미지 세트를 촬영한 후 다른 치료 용액이 포함된 미디어와 미디어를 교환합니다. pH 및 삼투압 변화를 방지하기 위해 이미징 30분마다 매체를 교체해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35mm 배양 접시	사르슈테트	83-3900
커버 유리	코 닝	2850-22
일회용 페트리 접시 (100 x 15mm)	폭스바겐	제25384-094
소 태아 세럼	써모피셔 사이언티픽	26140087
도립 현미경	니콘	TE2000 (영문
라미닌	써모피셔 사이언티픽	23017-015
레보비츠의 L-15 페놀 레드 미디엄	Gibco/Fisher Scientific	제11-415-064
페놀 레드가 없는 Leibovitz의 L-15 미디엄	Gibco/Fisher Scientific	Tel.: 21-083-027
페니실린/스트렙토마이신	써모피셔 사이언티픽	15140122
페놀 레드	시그마 알디치	P0290
폴리-D-라이신(PDL)	시그마 알디치	P7280
Steritop 0.22μm 필터	밀리포어	S2GPT05RE
Calcium Chloride Dihydrate (염화칼슘 이수화물)	피셔 사이언티픽	C79-500
포도당	시그마 알드리치	G7528 (영문
헤페스	시그마 알드리치	H4034

년 년 호 ) 년 호 (영문) )