출처: Camiré, O., et al. 뇌 절편의 뉴런 수상돌기에서 이광자 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2018).
이 비디오는 뇌 해마 절편에서 전체 세포 패치 클램프 기록 및 이광자 칼슘 이미징을 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 급성 뇌 절편에서 다양한 뉴런 유형의 수상돌기에서 국소 Ca2+ 과도 현상(CaT)의 역학을 연구할 수 있습니다.
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방법 논문
뇌 절편의 이광자 칼슘 이미징을 위한 전체 세포 구성 확립
944 조회수
⸱
2025년 7월 8일
이 논문에서
초록
프로토콜
동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 예비 준비 (선택 사항: 1일 전 준비)
- 3종류의 인공뇌척수액(ACSF) 용액(Normal, Sucrose, Recovery Solutions, 각 1L, 표 1 참조)을 준비합니다. 용액의 삼투압을 300 ± 10 mOsm으로 조정하고 ACSF-Sucrose를 거의 어는점(0-4 °C)으로 냉각합니다.
메모: 저염 절단 용액(ACSF-Sucrose)을 사용하면 급성 절편의 표재층에서 뉴런의 생존력을 보존하는 데 도움이 됩니다. - 적색 형광단(예: Alexa-594)과 녹색 합성 칼슘 지시약(예: Oregon Green BAPTA-1, 표 1 참조)이 포함된 패치 용액 0.75mL를 준비합니다. 기록된 세포의 사후 형태학적 식별이 필요한 경우 패치 용액에 biocytin(표 1 참조)을 포함합니다.
- 용액의 삼투압을 280 ± 5 mOsm으로, pH를 7.35 ± 0.5로 조정합니다. 용액을 항상 냉장고나 얼음 위에 보관하십시오.
메모: 칼슘 지표의 선택은 동적 범위와 조사된 Ca2+ 이벤트의 특성에 따라 결정되어야 합니다. - 마이크로피펫 풀러를 사용하여 ≈ 2 μm 팁(3-5 MΩ의 피펫 저항)이 있는 붕규산 유리 모세관(재료 표 참조)의 패치 피펫과 2-5 μm 팁이 있는 붕규산 세타-유리 모세관(재료 표 참조)의 자극 피펫을 준비합니다.
메모: 주어진 직경과 모양의 피펫을 만들기 위한 풀러 설정은 풀러 필라멘트 유형과 주어진 유리 유형에 대한 램프 테스트 결과에 따라 결정됩니다.
2. 전체 셀 패치 클램프 녹음
- 레이저 스캐닝 이광자 현미경의 대물렌즈(배율: 40x, 개구수: 0.8) 아래에 위치한 욕조에 해마 절편을 제자리에 놓습니다. 30-32°C에서 2.5-3mL/분의 속도로 가열된 산소가 공급된 ACSF-Normal로 수조를 지속적으로 관류합니다.
- 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC) 또는 Dodt-SGC 현미경을 사용하여 크기, 모양 및 위치를 사용하여 관심 세포를 찾습니다.
메모: 표적 뉴런 집단에 따라 형질전환 마우스 모델을 사용하여 관심 세포를 쉽게 찾을 수 있습니다. 이 경우, 이 단계는 형광 광원을 사용하여 대체할 수 있습니다. - 자극 피펫에 적색 형광단이 포함된 ACSF-Normal 용액(예: Alexa-594)을 채웁니다.
- 자극 피펫(전기 자극 장치에 연결됨)을 슬라이스 위에 설정하여 팁이 관심 세포와 동일한 영역에 있도록 합니다.
- 패치 피펫에 패치 용액을 채우고 헤드 스테이지에 부착한 후 팁이 관심 세포 바로 위에 오도록 슬라이스 위에 놓습니다.
- 주사기를 3방향 마개에 끼우고 플라스틱 튜브를 통해 패치 피펫에 연결합니다. 주사기를 사용하여 패치 피펫(≈ 0.1mL)에 일정한 양압을 주입합니다. 스톱콕을 "가까운" 위치에 유지하십시오.
- 활성화 ampliifier 제어 소프트웨어 모듈을 선택하고 vol로 전환tage-clamp "VC" 버튼을 클릭하여 모드를 선택합니다. 전기생리학적 신호 수집을 위한 전기생리학 데이터 수집 소프트웨어(예: clampex)를 열고 "멤브레인 테스트" 아이콘을 클릭하여 파이펫 저항의 변화를 모니터링하는 데 필요한 구형전압 펄스(5mV, 10ms)를 지속적으로 전송하도록 합니다.
- 대상 세포 바로 위에 올 때까지 패치 피펫을 내립니다. 세포막에 닿으면 스톱콕을 "열림" 위치로 돌려 압력을 제거합니다.
메모: 피펫 저항(≈ 0.2MΩ)의 작은 증가가 보일 때 세포막과의 접촉이 감지되며, 양압으로 인해 세포에 작은 움푹 들어간 곳이 발생합니다. - 소프트웨어에서 제공하는 피펫 저항이 1GΩ에 도달할 때까지 스톱콕에 장착된 빈 주사기를 사용하여 패치 피펫에 약간의 음압을 가합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 'Membrane Test' 창에서 셀을 -60mV로 고정합니다.
- 셀이 열리고 전체 셀 구성이 달성될 때까지 음압을 계속 가합니다. 이 세포 상태의 검출은 피펫 저항의 갑작스러운 변화(인터뉴런 유형에 따라 1GΩ에서 70-500MΩ까지)와 '멤브레인 테스트' 창에서 큰 용량성 과도 현상의 출현을 기반으로 합니다.
3. 이광자 칼슘(Ca2+)이미징
- 흥분성 시냅스후 반응에 관심이 있는 경우, GABAA 수용체 차단제 가바진(10μM) 및 GABAB 수용체 차단제 CGP55845(2μM)을 ACSF 수조에 첨가합니다.
- 증폭기 제어 소프트웨어 모듈에서 "CC" 버튼을 클릭하여 패치 구성을 전류 클램프로 설정하고 탈분극 전류(0.8-1.0 nA, 1 s)의 체세포 주입에 대한 응답으로 셀의 발사 패턴을 기록합니다. 패치 솔루션에 있는 지표로 셀이 채워질 때까지 최소 30분 동안 기다립니다.
메모: 세포의 발화 패턴과 활성 특성은 세포의 아형(subtype), 예를 들어 빠르게 급증하는 세포(fast-spiking cells)를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 칼슘 과도 현상(CaT)을 기록하기 시작하기 전에 확산을 통해 지표 농도가 안정화되는 것이 중요합니다(문제 해결은 표 2 참조). - AP 유발 CaT
- 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 이미지 획득을 시작합니다. 적색 형광 신호를 사용하여 관심 있는 수상돌기를 찾습니다. 가시적인 반응을 보장하려면 먼저 GABAergic interneuron에서 거리에 따라 AP 역전파의 효율성이 크게 감소할 수 있으므로 근위 수상돌기(≤ 50μm)를 선택합니다.
- 이미지 획득 소프트웨어의 '사각형 도구'를 사용하여 대상 영역을 확대하고 "xt"(라인스캔) 모드로 전환합니다. 관심 있는 수지상 가지를 가로질러 스캔을 배치합니다. 획득 소프트웨어의 레이저 강도 컨트롤러를 사용하여 광독성을 방지하기 위해 기준선 녹색 형광이 약간만 보이는 최소 출력 수준으로 이광자 레이저를 설정합니다.
- 전기생리학 데이터 수집 소프트웨어 '프로토콜' 창 및 이미지 수집 소프트웨어에서 원하는 진폭의 체세포 전류 주입을 포함하는 원하는 기간의 기록 시험을 만듭니다.
- 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 "기록 시작" 버튼을 클릭하고 1-2초 동안 지속적으로 형광을 획득합니다. 이미지 획득을 3-10회 반복합니다. 광손상을 방지하기 위해 단일 스캔 사이에 최소 30초를 기다리십시오. 덴드라이트를 따라 여러 지점에서 라인 스캔을 획득하는 경우 순서 효과를 피하기 위해 임의의 순서로 수행하십시오.
- 시냅스로 유발된 CaT
- 적색 형광 신호를 사용하여 관심 있는 수상돌기를 찾습니다.
- 자극 피펫을 관심 있는 수상돌기 위의 슬라이스 표면에 놓습니다. 자극 피펫을 천천히 제자리로 내리고 움직임을 최소화하여 전체 세포 구성을 방해하지 않도록 합니다. 피펫을 덴드라이트에서 10-15 μm 떨어진 곳에 놓습니다.
- 아스피니 수상돌기에서 시냅스 미세도메인의 위치를 시각화하려면 이미지 획득 소프트웨어에서 'xt'(라인스캔) 모드로 전환하고 관심 있는 수지상 가지를 따라 선을 배치합니다.
- '프로토콜' 창(전기생리학 데이터 수집 소프트웨어) 및 이미지 수집 소프트웨어에서 시험 시작 후 자극 장치를 트리거하는 기록 시험을 만듭니다.
- 획득 소프트웨어를 사용하여 "기록 시작" 버튼을 클릭하여 1-2초 동안 수상돌기를 따라 계속 스캔합니다. 획득을 3-5회 반복하고 스캔 사이에 30초 동안 기다렸다가 광손상을 방지합니다.
메모: 스캔 길이는 유발된 이벤트의 역학에 따라 조정할 수 있지만 광손상을 방지하기 위해 최소화해야 합니다(문제 해결은 표 2 참조). - 다루고 있는 특정 질문에 따라 다른 조건(예: 다른 자극 강도/길이, 약리학적 차단제 도입 등)에서 3.4.5단계를 반복합니다.
- 세포의 건강 악화 징후가 보이면 수집을 중지합니다: -45mV 미만의 탈분극, 기준선 Ca2+ 수준 증가, 수상돌기의 형태학적 열화(예: 블리빙, 단편화, 문제 해결은 표 2 참조).
- 세포의 형태에 대한 예비 정보를 얻고 자극 피펫의 위치를 기록하려면 빨간색 채널에서 세포의 Z-스택을 획득합니다. 'xyz' 모드에서 수집 소프트웨어를 사용하여 모든 프로세스가 포함된 전체 셀을 이미지화하기 위해 상한 및 하한 스택 한계를 설정합니다. '단계 크기'를 1μm로 설정하고 "기록 시작" 버튼을 사용하여 스택 수집을 시작합니다.
- Z-stack 획득이 완료되면 소프트웨어의 "최대 투영" 옵션을 사용하여 스택의 모든 초점 계획을 중첩하고 획득 품질을 확인합니다. 그런 다음 패치 피펫을 슬라이스에서 천천히 집어넣습니다.
- 사후 형태학적 식별을 위해 슬라이스를 고정하려면 평평한 페인트 브러시를 사용하여 수조에서 슬라이스를 빠르게 제거하고 ACSF로 채워진 페트리 접시의 두 여과지 사이에 놓습니다. ACSF를 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 교체하고 접시를 4°C의 방이나 냉장고에 밤새 두십시오.
표 1: 솔루션 레시피. 프로토콜 중에 사용되는 용액에 대한 화합물 및 농도.
의 호 호 개 분 분 개 의 호 호 분 분 개 개 호 분 분 의 개 의 분 개 분 개 의| 용액 | 구성 요소 | 농도 (mM) |
| ACSF- 정상 | 염화나트륨 | 124 |
| 케이클 | 2.5 | |
| 나H2PO4 | 1.25 | |
| 마그네슘SO4 | 2 | |
| 나HCO3 | 26 | |
| 포도당 | 10 | |
| 염화나트륨2 | 2 | |
| ACSF-복구 | 염화나트륨 | 124 |
| 케이클 | 2.5 | |
| 나H2PO4 | 1.25 | |
| 마그네슘SO4 | 3 | |
| 나HCO3 | 26 | |
| 포도당 | 10 | |
| 염화나트륨2 | 1 | |
| ACSF-설탕 | 케이클 | 2 |
| 나H2PO4 | 1.25 | |
| 마그네슘SO4 | 7 | |
| 나HCO3 | 26 | |
| 포도당 | 10 | |
| 자당 | 219 | |
| 염화나트륨2 | 1 | |
| K+ 기반 패치 솔루션 | K+-글루코네이트 | 130 |
| 헤페스 | 10 | |
| 마그네슘Cl2 | 2 | |
| 포스포크레아틴 디(트리스)소금 | 10 | |
| ATP-트리스 | 2 | |
| GTP-트리스 | 0.2 | |
| 바이오사이틴 | 72 | |
| 알렉사-594 | 0.02 | |
| 오레곤 그린-BAPTA-1 | 0.2 |
표 2: 문제 해결 표. Ca2+ 이미징 실험 중에 발생할 수 있는 일반적인 문제에 대한 해결책.
. .| 문제 | 용액 |
| 건강한 뉴런을 패치할 수 없음 | 조각이 건강에 해롭다는 징후가 있는지 확인하십시오 : 수축되거나 부어 오른 세포, 눈에 보이는 핵 등. 그렇다면 조각을 버리십시오. 또한 패치 피펫 저항과 패치 용액의 삼투압을 확인하십시오. 값이 적절한 범위에 있지 않으면 교체하십시오. |
| 수상돌기의 형광 신호가 낮습니다. | 셀이 채워질 때까지 더 오래 기다립니다. 장애물로 인해 패치 용액이 세포로 확산되는 것을 막고 있는 경우 패치 피펫에 소량의 음압을 가해 보십시오. |
| 전기 자극이 Ca2+ 반응을 유발하지 않음 | 전기생리학적 기록에 인공물이 있는지 확인한다. 없는 경우 단락/자극 장치 오작동을 확인하십시오. 존재하는 경우 자극 강도를 높이거나 자극 피펫을 덴드라이트에 더 가깝게 이동합니다. 자극 전극과 수상돌기 사이의 거리는 시냅스 반응을 연구할 때 수상돌기의 직접적인 탈분극을 방지하기 위해 8um을 초과해서는 안 된다는 점에 유의해야 합니다. |
| 유발된 Ca2+ 신호가 너무 높음/Ca2+ 표시기를 포화 상태로 만듭니다. | 레이저 출력을 줄입니다. 여러 셀에서 문제가 지속되면 Ca2+ 친화도가 낮은 다른 Ca2+ 지표를 사용합니다. |
| 기준선 Ca2+ 신호는 실험 중에 점진적으로 증가하고 있습니다. | 개별 검사 사이에 더 오랜 시간 동안 기다립니다. 기준선이 계속 증가하면 획득을 중지합니다. 이는 세포의 건강이 악화되고 있음을 나타냅니다. |
| 스캔 중에 Ca2+ 신호의 진폭이 감소합니다 | 레이저 출력을 줄이거나 축소합니다(해당되는 경우). |
| 수상돌기는 스캔 후 단편화("blebbing")됩니다 | 레이저 출력을 줄이거나 축소하십시오. 블리빙이 대상 덴드라이트로 제한되는 경우 다른 수상돌기를 선택하고 레이저 출력/축소를 줄입니다. 여러 개의 수상돌기가 삐걱거리는 경우 획득을 중지하십시오. |
| 형광 신호가 스윕 후 스캔 라인에서 "표류"하고 있습니다. | ACSF 관류 속도를 줄여 슬라이스의 움직임을 줄입니다. 패치를 적용하기 전에 슬라이스가 그물로 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오. |
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