쥐의 뇌에서 전기생리학적 기록을 통한 약물 미세주입

초록

출처: Lai, J., et al. 설치류 뇌에서 억제제의 동시 전기 생리학적 기록 및 미세 주입. J. Vis. 특급 (2015년)

이 프로토콜은 마취된 쥐의 표적 뇌 부위에 약물을 정확하게 전달하기 위한 주입체의 조립 및 사용을 개략적으로 설명한 다음 기록된 전기 신호를 통해 신경 세포 활동을 모니터링합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 녹음 주입 피펫 조립

1. 피펫 풀러를 사용하여 약 7cm 길이의 유리 모세관(외경 1mm)을 당깁니다.
2. 모세관 끝을 부러뜨리고 광학 현미경으로 조리개를 확인합니다. 내경이 30μm에서 40μm 사이인지 확인합니다.
3. 유리 피펫의 테이퍼되지 않은 끝에서 약 1cm 돌출된 7cm 길이의 은선을 유리 모세관에 삽입합니다.
4. 여분의 필라멘트를 유리 모세관에 직각으로 구부립니다.
5. 30G의 피하 주사 바늘 샤프트에 유연한 플라스틱 접착제 한 방울을 바릅니다.
6. 그림 30에 제시된 회로도에 따라 유리 피피하에 주사 바늘을 삽입합니다.
7. 두 번째 접착제 코팅을 추가하여 유리 피펫과 피하 주사 바늘 사이의 접합부에서 적절한 밀봉을 보장합니다.
8. 적절한 접착제 경화를 위해 팁이 위를 향하도록 피펫을 약 12시간 동안 건조시킵니다. 완성된 결과는 그림 2에 나와 있습니다.

참고: 이 절차는 급성 실험에서 수행되며 피펫 팁의 멸균이 필요하지 않습니다.

2. 동물 준비

1. 쥐를 마취 상자에 넣으십시오.
2. 4% 이소플루란을 사용하여 5-10분 동안 마
취를 유도합니다.
3. 체온을 37°C로 유지하기 위해 발열 패드와 직장 프로브가 있는 입체 테이블에 동물을 놓습니다.마취를 유지하기 위해 2% 이소플루란이 함유된 콧방울을 사용합니다. 이어바와 이빨 홀더를 사용하여 쥐의 머리를 고정합니다.
4. 동공 확장을 돕기 위해 안과 연고나 안약(1% 아트로핀 점안액 포함)을 바르십시오. 건조를 방지하려면 약 30분마다 윤활 방울을 바르십시오.
5. 머리를 면도하고 10% 포비돈 요오드로 청소합니다.
6. 국소 마취를 위해 0.5ml의 2% 리도카인을 피부를 들어 올려 바늘 끝을 삽입하여 두피 아래 2-3군데 주사합니다.
7. 발가락 꼬집기를 수행하고 움직임이 없는 것을 관찰하여 적절한 마취 수준을 확인합니다. 또한 심박수가 정상 값(300-400회/분) 내에 있는지 확인하기 위해 심박수를 모니터링해야 합니다.
8. #10 메스 날로 중앙을 따라 일직선으로 두피를 절개하여 관상 봉합사와 시상 봉합사를 모두 노출시킵니다.
9. 수술용 주걱으로 두개골을 덮고 있는 조직을 옆으로 밀어 람다와 브레그마 점을 드러냅니다.
10. 브레그마와 람다 위치가 같은 평면에 있도록 두개골의 수평을 맞춥니다.
11. 기준점을 설정하려면 유리관이 장착된 입체 장치를 사용하여 브레그마 바로 위에 설정합니다. 이것은 전후 및 내측-측면 측정 좌표에 대한 "0"이 됩니다.
12. 입체식 마운트를 필요한 좌표로 이동하여 관심 지점을 설정하고, 입체식 좌표를 기록하고, 개두술이 수행될 위치를 표시하는 대상 영역 주위에 사각형을 그립니다.
13. 멸균된 드릴이 있는 수술용 드릴을 사용하여 표시된 사각형을 따라 천천히 압력을 가하지 않고 뼈 물질을 제거합니다. 같은 부위를 너무 오래 뚫으면 열이 발생하여 피질에 병변이 생길 수 있으므로 주의하세요.
14. 개두술을 구분하는 뼈가 충분히 얇아지면 핀셋으로 두개골 부분을 조심스럽게 제거하여 피질을 노출시킵니다.
15. 조직 건조를 방지하기 위해 노출된 피질에 인공 대뇌 척수액을 자주 세척하십시오.
    메모: 주사제의 끝이 관통할 수 있을 만큼 튼튼하기 때문에 쥐에서 경암 제거가 필요하지 않습니다.

3. 주입 시스템의 충전 및 장착

1. 흡인에 의해 5-10 μl 마이크로 주사기에 미네랄 오일을 채웁니다.
2. 0.5% Chicago Sky Blue(CSB) 및 300μM γ-aminobutyric acid(GABA) 용액 또는 0.5% CSB 9가 포함된 2% 리도카인 용액으로 고정된 유리 피펫으로 피하 주사 바늘을 채웁니다. 모든 용액을 식염수로 희석하십시오.
   1. 물질이 풍부한 경우 일반 주사기를 사용하여 채우고 일반적인 예방 기술을 사용하여 기포 형성을 방지하십시오.
   2. 더 비싼 물질의 경우, 미네랄 오일을 사용하여 인젝트로드를 채울 수 있으며, 그런 다음 흡인에 의해 화학 작용제를 도입 할 수 있습니다. 미네랄 오일과 물의 밀도 차이는 상대적으로 높으므로이 물질은 수용액을 주입하기에 좋은 후보입니다 .
      메모: 두 액체 사이의 분리를 확인하기 위해 염료를 첨가할 수 있습니다.
3. 주입 피펫을 채우려면 1ml 주사기에 용액을 흡인하고 피펫에 천천히 주입합니다.
4. 그림 1에 표시된 영역의 누출에 주의를 기울여 이러한 영역을 깨끗이 닦고 주사기로 용액을 천천히 주입하여 누출을 관찰하십시오.
5. 주사기 1ml를 제거합니다. 이 경우 진공 청소기가 주입 피펫에서 용액을 제거하지 않도록 플런저에 가벼운 압력을 유지하십시오.
6. 마이크로 주사기에 미네랄 오일을 흡인하고 채워진 주입 피펫에 단단히 부착합니다. 그런 다음 거즈로 조립된 인젝트로드에서 여분의 용액을 조심스럽게 닦아냅니다.
7. 유리 피펫 끝에서 작은 물방울 형태가 보일 만큼 아주 작은 부피를 주입하여 팁이 막히지 않았는지 확인합니다.
8. 마이크로 펌프 시스템에 인젝트로드를 장착하고 잘 고정되었는지 확인하십시오.
9. 인젝트로드 팁을 목표 좌표에 조심스럽게 배치하고 팁을 피질 표면으로 내립니다.
10. 적절한 해부학적 좌표를 사용하여 입체성 장치를 사용하여 인젝트로드를 목표 구조(superior colliculus)까지 천천히 내립니다.
11. 조직 건조를 방지하기 위해 노출된 피질을 따뜻한 한천으로 덮습니다.

4. 주입 및 가역적 비활성화

1. 미세주입 펌프를 400-800nl을 40nl/분으로 주입하도록 설정하고 Run을 눌러 주입을 시작합니다. 스파이크 비율은 주입 중에 감소를 보여줍니다.
   참고: 실험 설정에서 GABA 전달이 끝난 후 한 시간 이내에 신경 활동이 회복되었습니다. 보정된 모든 기계 장치를 사용하여 미세 주입 주사기에 압력을 가하고 주입을 수행할 수 있습니다.
2. 전기생리학적 데이터를 얻은 후 지역 동물 윤리 커뮤니티에서 승인한 방법을 사용하여 안락사합니다.

결과

그림 1 : injectrode 어셈블리의 개략도. 마이크로 주사기(A)는 유리 피펫(D) 내부의 은선(C)에 부착된 30G 피하 주사 바늘(B)로 구성된 기록 주입 피펫에 부착됩니다. 원으로 표시된 영역(E-F)은 누출에 취약할 수 있는 영역을 강조 표시합니다.

그림 2 : 30G 바늘(B), 방수 접착 접착제(F), 은선(C) 및 유리 피펫(D)을 사용하여 제작된 피펫 사진.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
분사 펌프(UltraMicroPump III)	WPI (영어)	#UMP3
분사 콘솔(Micro4 컨트롤러)	WPI (영어)	#SYS-마이크로4
해밀턴 시린지	햄릿턴	(80301) 701LT 10μL SYR	5 - 10 μL 사이의 주사기 사용
겔 시아노아크릴레이트 접착제	크레이지 글루	KG86648R	젤 형태는 30G 피하 주사 바늘의 샤프트에 적용하기가 더 쉽습니다.
유리 피펫	WPI (영어)	#TW100F-4	얇은 벽, 1mm OD, 0.75mm ID, 필라멘트 피펫 사용
720 니들 피펫 풀러	코프	720
은선	AM 시스템, Inc.	782500	베어 0.010"
한천
모세관
피하 주사 바늘
시카고 스카이 블루(CSB)
γ-아미노낙산(GABA)
리도카인
아트로핀 방울
이소플루란
발열 패드
입체식 테이블
#10 메스 블레이드
미네랄 오일

명