mouse brain slice에서 GABA Puffing을 사용한 전체 세포 전류 기록

초록

출처: Feng, Y. et al., 뇌 절편에서 GABA의 퍼프 적용에 의해 유도된 전체 세포 전류.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 쥐의 전전두엽 피질 뇌 절편에서 감마 아미노부티르산(GABA)에 의해 유도된 전체 세포 전류를 기록하는 것을 보여줍니다. GABA의 제어된 전달은 시냅스후 뉴런에서 염화물 채널을 열어 억제성 시냅스후 전류 또는 IPSC를 생성합니다. 이러한 IPSC는 GABA 농도가 높을수록 증가하며, 이는 시냅스 전달에 대한 GABA의 억제 활성을 반영합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 솔루션 준비

1. 표 1에 나열된 대로 발표된 연구에 설명된 성분을 포함하는 표준 인공 뇌척수액(ACSF) 500mL를 준비합니다.
   1. 깨끗한 유리 비커에 탈이온수를 사용하여 새로운 ACSF 용액을 준비합니다. 염화나트륨 (NaCl), 염화칼륨 (KCl), 인산나트륨 나트륨 (NaH₂PO₄ ), 중탄산 나트륨 (NaHCO₃ ), 황산 마그네슘 (MgSO₄ ), D- 포도당을 첨가하기 전에 탈이온수로 주걱을 세척하고 건조시키고 용액을 95 % O₂ / 5 % CO₂ 로 거품을 낸 후 염화칼슘 (CaCl₂ ) 을 첨가합니다.~20분(표 1에 자세히 설명됨) 동안 500mL의 탈이온수 혼합물. 완전히 녹을 때까지 저어줍니다.
   2. ACSF가 강수량 없이 완전히 깨끗한지 확인하십시오. 그런 다음 pH를 7.2-7.4로 조정합니다. 95% O₂ 및 5% CO₂로 구성된 가스 혼합물로 ~20분 동안 거품을 일으
   킵니다.
2. 표 2에 설명된 화학 물질을 포함하는 250mL의 슬라이스 절단 용액을 준비합니다.
   1. KCl, 염화마그네슘(MgCl2), _NaH2PO4,NaHCO3, 콜린·Cl, D-포도당을 넣고 탈이온수 250mL에 1.1.1.1에 표시된 염화칼슘(CaCl2)을 마지막으로 넣고 1.1.1 및 1.1.2에 기재된 대로 용해합니다.
   2. 95% O₂/5% CO₂로 버블링한 후 용액을 냉동실에 15-20분 동안 넣어 절단 용액이 얼음처럼 차갑고 부분적으로 얼도록 합니다.
      메모: 우리는 1-2개월 된 생쥐에서 조각을 만들 때 이 절단 솔루션을 사용합니다. 포뮬러는 2개월 이상 된 마우스의 경우 다를 수 있습니다.
   3. 지질다당류(LPS) 용액을 멸균 내독소가 없는 등장성 식염수(0.9% NaCl)에 용해시켜 준비합니다. LPS는 복강내(0.5mg/kg)로 투여되고 2시간 후에 기록을 시작합니다.

2. 전전두엽 피질 절편의 준비

1. 냉동실에서 절단 용액을 꺼내 균질화하여 슬러시를 얻습니다. 용액을 얼음 위에 놓고 95% O₂/5% CO₂로 지속적으로 거품을 냅니다.
2. 크고 날카로운 가위를 사용하여 설명된 대로 쥐의 목을 빠르게 자르고 즉시 얼음처럼 차가운(0-4°C) 절단 용액을 채운 비커에 머리를 넣습니다.
3. 가느다란 가위로 꼬리에서 비강 방향으로 정중선을 따라 두개골 상단을 자르고 측면 두개골 부분을 제거합니다. 미세한 주걱으로 뇌를 제거하고 얼음처럼 차가운 절단 용액에 떨어뜨립니다.
   메모: 2.2-2.3단계는 빠르게(이상적으로는 1분 <) 수행해야 합니다.
4. 얼음으로 채워진 9cm 페트리 접시의 뚜껑에 뇌를 놓습니다. 얼음처럼 차가운 절단 용액으로 뇌를 헹굽니다. 면도날로 소뇌와 후각구를 잘라냅니다.
5. 비브라톰의 시편 홀더에 시아노아크릴레이트 접착제를 바르십시오. 접착제 방울에 뇌 블록을 조심스럽게 놓고 머리 쪽이 위로 향하게 하고 즉시 얼음처럼 차가운 절단 용액에 담그십시오.
6. 진동의 블레이드 홀더를 수평면을 기준으로 15° 각도로 조정하고 350μm 코로나 뇌 절편(블레이드 진동 주파수 = 85Hz, 속도 = 0.1mm/s)을 준비합니다.
7. 피펫을 사용하여 슬라이스를 ACSF로 채워진 회수 챔버로 옮기고 95% O₂/5% CO₂의 일정한 버블링으로 1시간(RT에서) 동안 배양합니다.

3. 전체 셀 패치 기록

1. Puller Operation Manual의 특정 지침에 따라 기록 전극 또는 퍼프 마이크로피펫으로 사용할 유리 붕규산 마이크로피펫을 만듭니다. 전극 기록의 경우 팁 저항은 4-6MΩ 범위인 반면 퍼프 마이크로피펫의 팁 직경은 2-5μm 범위입니다.
2. Na⁺ 채널 차단제(테트로도톡신(TTX), 1μM)를 추가하여 빠른 Na⁺ 채널과 활동 전위를 차단하고 ACSF에 추가하고 연동 펌프를 통해 챔버 내로 들어가고 흡인을 통해 기록 챔버에서 이 용액의 2-3mL/분의 일정한 유속을 유지합니다. 슬라이스의 생존력을 보장하기 위해 ACSF에 95% O₂/5% CO₂를 지속적으로 거품을 냅니다.
3. 변형된 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 절편을 기록실로 옮깁니다. 플랫폼에 슬라이스를 고정하기 위해 ≥2mm 간격의 평행한 나일론 나사산이 있는 플래티넘 슬라이스 앵커로 슬라이스를 덮습니다.
4. 기록 마이크로피펫에 내부 용액(표 3)을 채우고 퍼프 마이크로피펫에 10μM, 50μM 및 100μM(ACSF에 용해됨)에서 감마-아미노뷰티르산(GABA)을 채우거나 차량 제어로 ACSF를 채웁니다.
5. 이물질로 인한 막힘을 방지하려면 기록 전극을 ACSF에 담그기 전에 1mL 주사기를 사용하여 가벼운 양압을 가합니다. 현미경(4x 대물 렌즈) 아래에서 미세 조작기를 사용하여 팁이 모니터의 비디오 이미지 중앙에 나타나도록 기록 전극과 퍼프 마이크로피펫을 배치합니다(그림 1A).
6. 퍼프 마이크로피펫을 서서히 낮추면서 현미경 초점(40x 대물 렌즈)을 조정하고 45° 각도로 기록 뉴런 위에 놓습니다. 퍼프 마이크로피펫의 끝과 기록된 뉴런 사이의 거리를 20-40μm 사이로 유지합니다(그림 1B). 천천히 그리고 조심스럽게 기록 전극으로 뉴런에 접근한 다음 양압을 해제합니다. 전극 홀더에 연결된 튜브를 통해 약하고 짧은 흡입을 가하여 기가 옴 밀봉을 만듭니다.
7. 전압을 0mV로 유지하십시오. 기가 옴 씰을 형성한 후 수동 또는 자동으로 빠르고 느린 커패시턴스를 보상합니다. 그런 다음 위에서 언급한 튜브를 통해 짧고 강하게 흡입하여 전체 셀 모드로 들어갑니다.
8. vol에서 eIPSC를 기록합니다.tage-clamp 모드. 단일 또는 쌍의 GABA 퍼프를 전달하기 위해 Master 8 전압 스텝 발생기로 제어되는 Picospritzer를 사용하여 퍼프 마이크로피펫에 낮은 가스 압력(질소, 4 - 6psi)을 적용합니다(그림 2).

표 1. ACSF 녹음.

년 의 년 명 호 년 명 개 년 년 년 명 년 명 세 년 명 호

물질	g/몰	농도 (mM)	무게 (g/L)
염화나트륨	58.443	119	6.9547
케이클	74.551	2.5	0.1864
나H2PO4	137.99	1	0.1380
나HCO3	84.007	26.2	2010년 2월
재질 보기 MgSO4	120.366	1.3	0.1565
D-포도당	198.17	11	2.1799
염화칼슘2	110.98	2.5	0.2775

표 2. 슬라이스 절단 솔루션.

명 호 년 명 명 호 년 년 분 년 명 의 년 명 년 명

물질	g/몰	농도 (mM)	무게 (g/L)
케이클	74.551	2.5	0.1864
재질 보기 MgCl2	95.211	7	0.6665
나H2PO4	137.99	1.25	0.1725
나HCO3	84.007	25	2.1002
콜린·Cl	139.63	115	16.0575
D-포도당	198.17	7	1.3872
염화칼슘2	110.98	0.5	0.0555

표 3. 전체 세포 패치 기록을 위한 내부 솔루션.

명 개 년 표시기 분 개 명 분 년 명 개 년 명 개 년 명 세 년 개 년

물질	g/몰	농도 (mM)	무게 (g/L)
Cs 글루코네이트	328.052	100	32.8052
증권 시세	168.36	5	0.8418
헤페스	238.301	10	2.3830
재질 보기 MgCl2	95.211	2	0.1904
염화칼슘2	110.98	1	0.1110
밥타	476.433	11	5.2408
Na2ATP	551.1	4	2.2044
나2GTP	523.2	0.4	0.2093

결과

그림 1. 퍼프 마이크로피펫 및 기록 전극의 다이어그램.
(A) 퍼프와 기록 마이크로피펫 사이의 거리. (나) 뇌 절편 표면에 있는 퍼프 마이크로피펫(왼쪽)과 기록 전극(오른쪽).

그림 2. GABA 퍼프에 의해 유도된 IPSC의 픽크로톡신 봉쇄.
(가) ACSF 및 자당(50μM)을 퍼핑하면 반응이 없습니다.(B) 50...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
유리 붕규산 마이크로피펫	셔터 계기판	BF150-86-10	1.50 mm 외경; 0.86 mm 내경
마이크로피펫 풀러	셔터 계기판	모델 P-97	플레밍/브로우 마이크로피펫 풀러
마이크로 매니퓰레이터	셔터 계기판	MP-285
컴퓨터 제어 증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B
디지털 수집 시스템	분자 장치	디지데이터 1440A
이미징 카메라	니콘	2115001	검사 장비
현미경 검사 법	니콘	이클립스 FN1
마스터 8	A.M.P.I.	Master-8 펄스 자극기
비브라톰 슬라이서	라이카	VT 1000S
Picospritzer	파커 하니핀		세포 연구에서 피콜리터 부피 배출을 위한 압력 시스템
면도날	질 레트	74-S	플라잉 이글
비디오 모니터	파나소닉	WV-BM 1410
502 접착제	델리	7146	시아노아크릴레이트 접착제
연동 펌프	상하이 JIA PENG 공사	BT100-1층
비디오 카메라	올림푸스 아메리카 메디컬	올리-150
파이펫 이송	바이오로직스	제30-0138A1

(검정) 시리즈 년 년 호