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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 외부 및 내부 솔루션
- 포유류 Ringer's solution을 망막 박리 중에 사용하고 후속 전기 생리학적 기록에서 외부 솔루션으로 사용합니다. 기록 당일 10x 원액(칼슘 없음)에서 포유류 Ringer's solution을 준비하고 발암 15분 후(95% O2 및 5% CO2) CaCl2를 적가합니다. 최종 1x 용액에는 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0.8 Na2HPO4, 0.1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1 MgSO4 및 10 D-포도당이 포함됩니다.
- 두 가지 내부 솔루션을 사용하여 SAC 진동을 특성화할 수 있습니다. 성체 마우스 망막 신경절 세포(RGC)에 대한 장기간의 전체 세포 패치 클램프 기록에서 준비된 용액의 유용성을 테스트하고 검증된 배치를 사용할 때까지 -20°C에서 500μl 분취량에 보관합니다.
- 막 전위 진동을 기록하려면 125K-글루코네이트, 8NaCl, 4 아데노신 삼인산(ATP)-Mg, 0.5 리-구아노신 삼인산(GTP), 5 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA), 10 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 0.2% 비오시틴(w/v)을 포함하는 칼륨 기반 내부 용액을 사용합니다. KOH로 pH를 7.3으로 조정합니다.
- 흥분성 및 억제성 시냅스후 전류를 기록하려면 100 Cs-메탄설포네이트, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0.5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES 및 0.2% 바이오시틴(w/v)을 포함하는 세슘 기반 내부 용액을 사용합니다. CsOH를 사용하여 pH를 7.3으로 조정합니다.
2. 녹음 당일 준비
- 구멍이 뚫린 니트로셀룰로오스 멤브레인을 준비하려면 무딘 16G 주사기 바늘로 만든 맞춤형 펀처로 멤브레인을 수동으로 펀칭하고 두 개의 깨끗한 유리판 사이의 멤브레인을 평평하게 만듭니다. 전체 마운트 망막의 경우 중앙 구멍을 직경 0.2mm로 만들고 직경이 1-1.2mm인 4개의 큰 구멍으로 둘러쌉니다.
- 내부 용액을 전극에 로드하기 위한 맞춤형 백필 필라멘트를 만들려면 10μl 피펫 팁을 가운데에서 녹이고 용융된 부분이 냉각되고 굳을 때까지 부드럽게 늘립니다. 사용 직전에 깨끗한 면도날을 사용하여 패치 피펫보다 약간 길어질 때까지 필라멘트를 다듬습니다.
- 내부 필라멘트가 있는 붕규산 유리관에서 프로그래밍 가능한 풀러로 패치 피펫을 당깁니다. 실험 당일에 마이크로피펫을 제조하여 즉시 사용하십시오.
메모: SAC를 기록하기 위해 다음 풀러 설정을 사용합니다. heat: 484; 당기기: 0; 속도: 25; 지연 시간: 1; 압력: 400 및 램프 값 462. 붕규산염 튜브의 외경(O.D.) 및 내경(I.D.)은 각각 1.65mm와 1.0mm입니다. 피펫의 저항은 10-14 MΩ입니다.
- 조직 적출 1시간 전에 내부 용액 튜브를 소용돌이에서 >30분 동안 흔들어 해동합니다.
3. 망막 해부
- 동물이 발가락 꼬집음에 대한 반응을 잃을 때까지 산소에 4% 이소플루란을 마취합니다. 경추 탈구로 동물을 희생하십시오.
- 뾰족한 홍채 가위로 시신경두에서 1-2mm 떨어진 시신경에서 양쪽 안구를 잘라냅니다.
- 깨끗한 종이 타월에 안구를 굴려 혈액을 제거한 다음 발암 포유류 Ringer's solution에 담그십시오. 23G 바늘로 가장자리에 구멍을 뚫고 마이크로 가위로 가장자리를 따라 잘라 안구를 이등분합니다. 가는 집게를 사용하여 각막과 수정체를 제거합니다.
- 망막 전체를 장착하려면 가는 집게로 색소가 있는 상피에서 망막 전체를 부드럽게 벗겨내고 가장자리에서 시신경두를 향해 1.5-2mm의 직교 절단을 4번 만듭니다.
- 펀칭된 니트로셀룰로오스 막을 접시에 담그고 신경절 세포층(GCL) 면이 위로 향하게 하여 망막을 부드럽게 드래그합니다. 전체 마운트 망막을 준비할 때 시신경두를 중앙 구멍에 놓습니다. 망막이 있는 멤브레인을 다른 깨끗한 접시에 옮깁니다. 고운 페인트 브러시로 망막을 부드럽게 평평하게 하여 몰타 십자가처럼 보이게 하고 구멍 위에 네 모서리를 모두 놓습니다.
- 한 번에 망막의 일부를 검사해야 하는 경우, 3.3단계에서 제조한 각 아이컵을 색소가 침착된 상피가 부착된 면도날로 3-4조각으로 자릅니다. 사용하지 않는 조각은 발암된 외부 용액에서 빛으로부터 보호하고 12시간 이내에 사용하십시오.
- 니트로셀룰로오스 멤브레인을 마른 여과지 조각으로 닦아내고 집게와 페인트 브러시로 유리체 및 내부 제한 멤브레인을 제거합니다.
- 바닥에 밀봉된 유리 덮개 슬립이 있는 녹음 챔버로 어셈블리를 옮기기 전에 모든 망막 가장자리가 멤브레인에 완전히 부착되었는지 확인하십시오. 진공 그리스로 멤브레인을 커버 슬립에 고정하고 외부 용액으로 망막에 수분을 공급합니다. 어셈블리 아래에 기포가 끼지 않도록 주의하십시오.
- 챔버를 정립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 분당 ~3ml의 속도로 따뜻한(34-35°C) 발암된 외부 용액으로 챔버를 관류합니다.
- 먼저 10x 대물렌즈로 망막을 검사한 다음 60x 수침 렌즈를 사용하여 미분 간섭 대비(DIC) 및/또는 상피 형광 하에서 GCL 및 내부 핵층(INL) 뉴런을 확인합니다. tdTomato를 발현하는 SAC를 시각화하려면 백색 LED(Light-Emitting Diode) 광원을 554nm의 여기 필터 및 581nm의 방출 필터와 함께 사용합니다.
4. 플랫 마운트 망막에서 전체 셀 패치 클램프 녹음
- 주사기 필터를 통해 내부 용액을 맞춤형 백필 필라멘트로 필터링합니다.
- 필라멘트를 갓 뽑은 마이크로피펫에 삽입하고 용액이 은전극 와이어를 >5mm 덮을 때까지 팁 근처에 내부 용액을 분배합니다. 흡입 폴이 있는 전극 홀더에 마이크로피펫을 고정하면 튜브로 연결된 10ml 플라스틱 주사기의 플런저를 밀거나 당겨 전극 내부의 압력을 조정할 수 있습니다.
- 대물렌즈 아래에서 피펫을 찾아 망막 위 ~100μm까지 내립니다. 전류 팔로워 모드(I = 0)에서 DC 오프셋을 사용하여 정상 DC 전압 신호를 0으로 만듭니다. 전류 cl에서 피펫 저항을 측정합니다.amp (IClamp) 수조에 있는 동안 피펫을 통해 고정 진폭 구형파 전류를 주입하여 모드를 선택하고 Raccess 손잡이를 돌려 차이를 중화합니다. Raccess 손잡이의 판독값을 사용하여 옴의 법칙에 의한 피펫 저항을 계산합니다.
- 전극을 망막 위 ~10μm까지 천천히 가져옵니다. 전극에 양압을 가합니다. 피펫 팁이 망막에 접근함에 따라 반사가 변하는 것을 관찰하십시오. 빠르지만 부드럽게 피펫을 GCL에 밀어 넣고 즉시 양압을 낮추십시오.
- 피펫을 라벨링된 뉴런 쪽으로 이동합니다. 뮐러 세포의 다른 뉴런, 혈관 및 말단발과의 접촉을 피하십시오. 전극 막힘을 방지하기 위해 필요한 경우 더 많은 양압을 가하십시오.
- 보조개가 보일 때까지 피펫 팁을 라벨링된 뉴런의 정중선 근처에 놓습니다. 양압을 해제하고 원형질막이 피펫 팁으로 다시 튀어 오르도록 합니다.
- 피펫에 20-120pA 음전류를 적용하여 기가옴 밀봉 형성을 돕습니다. 필요한 경우 원형질막을 피펫으로 당기기 위해 부드럽게 흡입합니다. 밀봉 형성 후 세포막이 파열될 때까지 5분 동안 기다립니다. 이를 통해 유출된 내부 용액을 과융합으로 제거할 수 있습니다. 부드러운 흡입으로 멤브레인을 파열시킵니다.
- 멤브레인 파열 후 현재 CL에 있는 동안amp 모드에서 브리지 밸런스를 켜고 Raccess 손잡이를 사용하여 조정합니다.
메모: SAC와 같은 작은 셀의 경우 약간의 조정만 필요합니다. 또는 셀을 각각 염화물(약 -75mV) 및 글루타메이트(약 0mV)의 반전 전위로 유지하여 전압 클램프 모드(V클램프)에서 여기 및 억제 시냅스 후 전류를 기록합니다. 간헐적인 망막 및/또는 micromanipulator drift를 수용하기 위해 필요한 경우 피펫 위치를 확인하고 조정하십시오.
- 약물 치료 전, 치료 중 및 치료 후의 막 전위 또는 현재 변화를 기록하기 위해 시냅스 차단제(예: 시안퀵살린[CNQX], (2R)-아미노-5-포스폰펜타노에이트[AP5], 픽크로톡신, 투보쿠라린 등) 및 채널 조절제(예: 플루피르틴, 도파민, 메클로페나믹산 등)를 냉동 재고에서 실험 당일 신선하게 준비합니다. 발암성 Ringer's solution으로 약물을 희석합니다. 관류를 통해 배치 방식으로 적용하십시오.
- 기록 후 소마에서 피펫을 부드럽게 제거합니다. 챔버에서 어셈블리를 깨끗한 접시로 옮깁니다. 고정하는 동안 망막의 평탄도를 보장하기 위해 구멍이 뚫린 구멍이 없는 다른 평평한 니트로셀룰로오스 멤브레인에 망막을 분리했다가 다시 부착합니다.