전기생리학적 기록(Electrophysiological Recordings for Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices)

초록

출처: Heidemann, M., et al. 다중 전극 어레이에서 성장한 유기형 척수 공동 배양에서 기능적 재생 조사. J. Vis. 특급. (2015).

이 비디오는 다중 전극 어레이 또는 MEA 장치를 사용하여 캡처한 척수 절편의 유기형 공동 배양에서 얻은 전기생리학적 기록을 보여줍니다. 이러한 기록은 절편 사이의 신경 세포 재생을 평가합니다. 관찰된 동기화된 전기 활동은 성공적인 신경 재생을 확인합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. MEA에 척수 조직 슬라이스 장착

1. 인큐베이터에서 멸균 영양 배지를 예열합니다(37°C, 산소 공급을 위해 뚜껑을 가볍게 풀음).
2. 전극 어레이에 초점이 맞춰진 실체 현미경 아래 페트리 접시에 고무로 덮인 팁이 있는 멸균 핀셋이 있는 다중 전극 어레이 또는 MEA를 배치합니다. 6μl의 치킨 플라즈마 방울을 깨끗하고 먼지가 없는 멸균 전극 어레이의 중앙에 놓습니다. 작은 주걱을 사용하여 복부 측면이 서로 마주 보도록 두 개의 척수 부분을 혈장 방울에 조심스럽게 밀어 넣습니다. 주걱으로 전극을 만지지 마십시오.
3. 닭 혈장 방울 주위에 8μl의 트롬빈을 추가합니다. 트롬빈 피펫 팁을 사용하여 치킨 플라즈마/트롬빈 혼합물을 조심스럽게 섞어 두 조각 주위에 펴 바릅니다. 다시 말하지만, 부서지기 쉬운 전극 어레이를 직접 만지지 마십시오. 응고 직전에 과도한 닭 혈장/트롬빈을 흡입하십시오.
4. MEA/배양 어셈블리가 37°C의 인큐베이터 내부의 가습 챔버에서 약 1시간 동안 방치되는 동안 높은 습도를 유지하기 위해 페트리 접시의 뚜껑을 닫습니다.
5. 배양실에 10μl의 영양 배지를 조심스럽게 추가하고 페트리 접시의 뚜껑을 씌운 다음 약 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
6. 멸균 및 고무로 덮인 팁이 있는 각 MEA/배양 어셈블리를 롤러 튜브에 넣고 영양 배지 3ml를 추가한 다음 뚜껑을 단단히 닫습니다. 롤러 튜브를 롤러 드럼에 넣고 37 ° C에서 5 % CO₂ 함유 분위기의 인큐베이터에서 1 - 2 rpm으로 회전합니다.
7. 7일 후 체외(DIV) 후 영양 배지의 절반을 교체하고 그 후에는 일주일에 1-2회 교체하십시오.

2. 기계적 병변

1. 롤러 튜브에서 멸균 및 고무로 덮인 팁이 있는 MEA/배양 어셈블리를 꺼내 조직에 초점을 맞춘 실체 현미경 아래 영양 매체가 없는 페트리 접시에 넣습니다. 두 조각이 융합되어 있는지 육안으로 확인합니다.
2. MEA에 끝이 고무로 덮인 핀셋을 놓아 MEA/배양 어셈블리를 안정적으로 잡습니다.
3. 메스 날을 조직 조각에 가까운 MEA의 홈에 놓습니다. 메스를 약간 수평으로 잡습니다.
4. 메스 손잡이를 들어 올리되 메스 날이 바닥에서 끝까지 "굴러가서" 홈을 덮고 있는 조직을 절단하는 방식으로 메스 날이 MEA의 홈에 머물도록 합니다.
5. 필요한 경우 25G 바늘 끝으로 잔여 조직 연결을 심하게 합니다. 홈 안에서만 작업하고 부드러운 가장자리를 만지지 마십시오.
6. MEA/배양 어셈블리를 롤러 튜브에 다시 넣습니다. 배양액에 3ml의 신선한 영양 배지를 제공하고 인큐베이터의 롤러 드럼에 다시 넣습니다.

3. 자발적 활동의 전기생리학적 기록

1. 선택한 DIV 수 이후 두 척수 절편 간의 기능적 재생을 조사하려면 현미경의 기록 챔버에 MEA/배양 어셈블리를 장착하고 약 500μl의 세포 외 용액을 적용합니다(재료 목록 참조).
2. 시스템이 안정화될 수 있도록 첫 번째 녹음 전에 10분 정도 기다립니다.
3. RT에서 MEA의 각 활동 감지 전극에서 약 10분 동안 기본 자발적 활성을 2회 기록합니다.
4. 안정적인 세포 외 상태를 보장하려면 모든 기록 세션 후에 세포 외 용액을 교환하십시오.
5. 네트워크 억제를 해제하려면 스트리크닌(1μM)과 가바진(10μM)이 포함된 세포외 용액을 적용합니다.기록을 시작하기 전에 최소 2분 동안 기다립니다.

4. 데이터 분석

참고: 세포 외로 기록된 활동 전위를 감지하려면 표준 편차를 기반으로 하는 검출기와 각 전극에 대한 후속 판별기를 사용하십시오.

1. 각 전극의 감지된 신경 세포 활동을 표준 절차에 따라 래스터 플롯에 표시합니다(그림 1F).
2. 10msec의 슬라이딩 윈도우 내에서 해당 채널의 이벤트 수를 요약하고 1msec 단계씩 이동하여 각 슬라이스에 대한 총 네트워크 활동을 결정하고 표시합니다(그림 1G).
3. 각 슬라이스에서 개별 버스트(여러 전극에 나타나는 활동 클러스터)를 감지합니다. 따라서 해당 총 네트워크 활동에서 최소 피크 활동 임계값을 설정하고 각 버스트 시작 및 버스트 종료를 정의합니다. 예를 들어, 적절한 임계값은 평균 버스트 진폭의 25%이고, 버스트 시작은 최소 5msec의 시간 창에서 첫 번째 이벤트로 정의될 수 있으며, 버스트 종료는 최소 25msec의 시간 창에서 마지막 이벤트로 정의될 수 있습니다.
4. 기능적 재생을 정량화하려면 두 슬라이스 사이의 동기화된 버스트의 백분율을 계산합니다. 이렇게 하려면 한 슬라이스의 버스트와 다른 슬라이스의 다음 버스트 사이의 지연 시간을 계산합니다.
   메모: 버스트 쌍은 지연 시간이 평균 버스트 길이보다 작을 때 "동기화"라고 합니다. 특히 활동이 많은 공동 문화에서는 양쪽이 선택한 대기 시간 창에서 우연히 버스트를 시작할 가능성이 있습니다. 이 사실은 동기화된 버스트의 백분율을 정량화할 때 고려되어야 합니다.

결과

그림 1. 자발적 활동의 표시 및 분석. (A) MEA 다이어그램. 백금으로 덮인 전극은 검은색, 투명 전선은 빨간색, MEA 중앙의 홈은 노란색으로 표시됩니다. (B) MEA의 중앙에 위치한 전극 어레이의 클로즈업. (C) 8 DIV 오래된 문화의 명시야 이미지. 조각은 서로 마주보는 측면을 따라 성장하고 융합되었습니다. 노란색 막대는 MEA의 전극 및 절연이 없는 홈을 나타냅니다. 스케일 바 = 400μm (D) 실험 타임라인. E14 쥐 배아의 두 척수 절편을 MEA에 나란히 놓습니다. 며칠 안에 조각이 자라며 서로 마주보는 면을 따라 융합됩니다. 8 - 28 DIV의 시간 프레임에서 융합 부위를 통해 완전한 병변이 수행됩니다. 2-3주 후, 자발적 활성이 기록되고 배양물은 면역조직화학적 염색을 위해 고정됩니다. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
평면 다전극 어레이	콰네 바이오사이언스		우리 실험실의 디자인에 따라 맞춤 제작
영양 배지			100ml용
Dulbeccos는 독수리의 매체를 수정했습니다.	지브코	31966-021	80 밀리리터
호스 세럼	지브코	제26050-070	10 밀리리터
증류수, 멸균수			10 밀리리터
신경 성장 인자 -7S [5ng/mL]	시그마-알드리치	N0513	200 μL
			1% BSA를 함유한 세척 용액에서 재구성
세포외 매트릭스 겔	BD 바이오사이언스	제356230	항상 차갑게 유지해야 합니다. 태아기 및 배아 뉴런에 최적화된 매체로 1:50으로 희석합니다
세포외 용액(pH 7.4)			[엠]
염화나트륨			145
케이클			4
마그네슘Cl2			1
염화나트륨2			2
헤페스			5
나-피루브산			2
포도당			5
가바진	시그마-알드리치	SR-95531
마이크로피펫	월드 정밀 기기, Inc.	MF28G-5
스트리크닌	시그마-알드리치	S0532	유독
조직배양 편평한 튜브 10 (= 롤러 튜브)	테크노 플라스틱 제품 AG	91243

년 호 【무수정유출】 호 . 의 개 개 개 개 개 개