1차원 패턴화된 신경 세포 배양의 외부 흥분(External Excitation of one-dimensional patterned neuronal cultures)

초록

출처:Stern, S., et al. 1차원 및 2차원 배양에서 전기장 및 자기장을 사용하는 뉴런의 외부 여기. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 균일한 단방향 전기장으로 선 패턴의 신경 세포 배양을 자극하는 기술을 보여줍니다.

프로토콜

1. 형광 염료를 사용한 신경 세포 배양에서 자발적 또는 유발 활동의 이미징.

1. 50μL DMSO(디메틸 설폭사이드)에 50μg의 칼슘 민감성 형광 염료(재료/시약 표 참조) 용액을 준비합니다.
2. 10 Hepes, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 sucrose (pH 7.4)를 함유하는 (mM 단위) 세포외 기록 용액(EM)을 제조합니다.
3. 칼슘에 민감한 형광 염료 용액 8μL를 2mL EM에서 1시간 동안 배양합니다.빛을 차단하고 부드럽게 회전하여 염료가 세포에 균일하게 퍼질 수 있도록 합니다.
4. 이미징 전에 용액을 새 EM으로 교체하십시오. 형광 이미징은 그림 1에 나와 있습니다.
5. 칼슘 형광 이미징(488nm에서 여기 피크, 520nm에서 방출 피크)을 위한 광학 필터가 있는 형광 현미경의 이미지, 현미경의 시야 내에서 모든 관심 영역(ROI)의 강도를 정량화할 수 있는 카메라와 소프트웨어를 사용하여 이미지.

2. 문화의 전기 자극

참고: 전기 자극을 위한 기본 설정은 그림 2에 나와 있습니다. 약 14일 동안 신경 배양액이 성장한 커버 슬립을 형광 현미경 아래 페트리 접시에 넣습니다. 뉴런의 전기적 활성은 칼슘에 민감한 염료를 사용하여 이미지화되며, 배양 외부에 위치한 두 쌍의 수조 전극을 통해 전압이 가해집니다. 전극은 신호 발생기에 의해 구동되며, 신호 발생기의 출력은 이중 채널 증폭기에 의해 증폭됩니다. 자극을 위한 전압 제어는 전기장 벡터가 직접 결정되어 간단한 벡터 추가 및 결합이 가능하기 때문에 보다 표준적인 전류 제어보다 선호됩니다. 이를 위해서는 전기장의 균일성을 주의 깊게 확인해야 하며, 이는 전압 제어의 경우 전체 샘플에 대해 수행할 수 있습니다. vol을 사용할 때tage 제어 루프를 피하기 위해 주의를 기울여야 하며 전기장의 균질성을 확인해야 합니다.

1. 균일한 전기장을 사용한 전기 자극의 경우 한 쌍의 병렬 전극 와이어를 사용하십시오.
   1. 두께가 0.005''(127μm) 정도인 백금으로 만든 전극을 사용하십시오. 13mm 커버슬립과 함께 사용하는 경우 두 전극 사이의 거리가 약 11mm인지 확인하고 전극을 배양물에서 1mm 위로 배치합니다.
      알림: 전극 홀더(그림 3A)를 만들려면 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)을 사용하십시오. PTFE를 통해 좁은 구멍을 뚫어 전극을 삽입합니다. 장치는 전극이 노출되는 상단 끝이 용액과 접촉하지 않도록 세포외 용액보다 높아야 합니다. 절연을 위해 노출될 수 있는 전극 리드의 모든 부분에 에폭시 접착제를 사용하십시오.
   2. 전기 분해를 피하기 위해 DC 구성 요소가 없는 50% 듀티 사이클의 사각형 펄스 모양을 사용하십시오. 배양물을 태우지 않고 효과적인 자극을 유발하기 위해 펄스 지속 시간을 10μs와 4ms 사이로 변경합니다. 진폭이 ± 22V 순서인지 확인합니다(그림 3 참조). 사각 펄스는 전극에 병렬로 연결된 오실로스코프에서 관찰할 수 있습니다.
      메모: 원하는 파형을 쉽게 프로그래밍하려면 상용 파형 편집 소프트웨어를 사용하십시오(재료 목록 참조). 원하는 파형을 그래픽으로 입력하고 파형 생성기로 보냅니다.
2. 자기장 균질성을 테스트하려면 프로브 전극을 사용하십시오. 최소 1mm x 1mm의 그리드를 사용하여 전극 사이의 영역에서 프로브를 이동하고 전위를 측정할 수 있습니다.
   1. 전위를 측정합니다. 을 사용하여 전기장을 계산합니다. 전극 중 하나를 기준 전극으로 사용합니다. 100 μs에서 4 ms 사이의 다양한 펄스 지속 시간으로 전기장을 측정하여(100 μs 펄스 지속 시간의 예는 그림 3B 참조) 자기장이 자극 지속 시간 범위 내에서 균일한지 확인합니다.
      메모: 그림 3D는 펄스 지속 시간이 1ms일 때 측정된 전기장 균질성의 예를 참조하십시오.

결과

그림 1: 동기 네트워크 버스트 동안 이미지화된 칼슘 과도 현상의 예. 칼슘 염료로 실험하기 전에 염색된 뉴런의 이미지. 나. A에서 ROI의 intensity vs. time의 Traces로, Trace의 색상은 A의 ROI 경계선 색상을 나타냅니다. 3개의 ROI 내에서 동기화된 intensity의 큰 증가는 네트워크 버스트를 나타냅니다[삽입 그림 2]

그림 2: 신경 세포 배양의 자기 자극에 사용되는 설정의 개략도. ᅡ. 상단...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화칼슘, 1M	플루카	21098	세포외 기록 솔루션.
D-(+)-포도당, 1M	시그마-알드리치	65146	도금 매체, 세포외 기록 솔루션.
헥스, 1M	시그마-알드리치	H0887	세포외 기록 솔루션.
KCl, 3M	머 크	1049361000	세포외 기록 솔루션.
염화마그네슘, 1M	시그마-알드리치	M1028	세포외 기록 솔루션.
염화나트륨, 4M	바이오 랩	19030591	세포외 기록 솔루션 .
설탕, 1M	시그마-알드리치	S1888	세포외 기록 솔루션.
전극, 전선	AM 시스템, 칼즈버그 WA	767000	신경 세포 배양의 전기 자극.
신호 발생기	BK정확성	4079	전기 신호의 형성.
증폭기	만든		신호 발생기에서 전극으로의 신호의 전압 증폭.
전원 공급 장치	행렬	MPS-3005 LK-3	스퍼터링 기계에 전원 공급 장치.
백금 와이어 0.005 ''두께; AM 시스템,	칼스버그, WA	767000	신경 세포 배양의 전기 자극.

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