자기장에 의한 패턴화된 신경 배양의 자극(Stimulation of patterned neuronal cultures by a magnetic field)

초록

출처: Stern, S., et al., External Excitation of Neurons Using Electric Field and Magnet in One-and Two-Dimensional Cultures. J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 시간에 따라 변하는 자기장을 사용하여 커버슬립의 패턴이 있는 원형 고리에서 성장한 신경 배양을 자극하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 1D 배양을 위한 커버슬립 준비.

1. 75mL DDW, 25mL 25% 암모니아 용액 및 25mL 30% 과산화수소로 구성된 기본 피라냐 용액에 담그면 유리 커버슬립을 세척할 수 있습니다. 유리 커버 슬립이 있는 용액을 ~ 50°C의 가열판에 30분 동안 놓고 유리 커버 슬립을 질소로 건조시킵니다.
2. 먼저, 커버 슬립은 6 Å 두께의 얇은 크롬 필름 (99.999 %)으로 코팅 된 다음 증기 또는 스퍼터 증착을 사용하여 30 Å 금 층 (99.999 %)으로 코팅됩니다.
   1. 0.05 – 1 Å /s의 스퍼터링 속도를 달성하려면 2개의 e-빔이 있는 스퍼터링 기계와 대상 크기가 2" 및 4"인 260l/s의 진공 시스템을 사용하십시오. RPM(분당 0회에서 100회)까지 이동할 수 있는 회전 스테이지를 사용합니다. 0-750W의 직류(DC) 스퍼터 전력을 사용하십시오.
   2. 챔버에서 10mTorr 압력으로 플라즈마를 얻으려면 장치를 30rpm으로 회전하고 99.999%에서 아르곤을 사용합니다.
   3. 크롬의 경우 40W DC 스퍼터 전력에서 스퍼터링 건의 전원 공급 장치를 작동하여 ~ 0.12 Å / s 커버리지 속도로, 금의 경우 10W DC 스퍼터 전력으로 ~ 0.28 Å / s로 이어집니다.
3. 초음파를 사용하여 30분 동안 100mL ABS AR 에탄올에 0.1g 1-옥타데칸네티올 0.1g을 녹입니다. 이 용액에 Cr-Au 코팅된 커버슬립을 2시간 동안 놓고 에탄올 ABS AR로 세척하고 질소로 건조합니다.
4. 100 mL Dulbecco의 인산염 완충 식염수(D-PBS) 용액과 3.5 g의 삼중 블록 공중합체(재료/시약 표 참조) 용액을 600 - 700 rpm에서 1 - 2 시간 동안 교반하여 준비합니다. 커버슬립을 용액에 1시간 동안 놓습니다. 질소로 커버슬립을 건조시킵니다.
5. 생물 거부 층을 긁어 원하는 패턴을 기계적으로 에칭합니다. 펜을 에칭 바늘로 교체하는 펜 플로터를 사용하여 이 작업을 수행합니다. 금속 층을 통해 패턴을 긁어 밑에 있는 유리에 도달합니다. 복제된 원하는 패턴을 얻기 위해 컴퓨터로 이 프로세스를 제어합니다. 이 프로세스에 의해 형성된 패턴은 그림 1과 그림 2에 나와 있습니다.
6. 100 mL D-PBS, 3.5 g 트라이 블록 공중합체, 35.7 μL/mL 피브로넥틴 및 29 μl/mL 라미닌의 생체 적합성 층을 준비합니다.
   1. 커버슬립을 자외선에서 최소 10분 동안 살균합니다. 준비된 생체 적합성 용액에서 커버슬립을 밤새 배양합니다.
      참고: 생체 적합성 층은 이전 단계에서 생물 거부 층이 에칭된 곳에만 형성됩니다.
   2. 다음 날, P-DBS로 커버슬립을 두 번 세척합니다. 하룻밤 동안 PM에서 배양하십시오. 이제 커버슬립이 셀 도금을 할 준비가 되었습니다.

2. 신경 배양의 유지.

1. (mL당): 0.9mL MEM+3G, 0.1mL HI HS, 10μL 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUDR)과 우리딘 100x로 구성된 변화 매체(CM)를 준비합니다.
2. (mL당): 0.9 mL MEM+3G 및 0.1 mL HI HS로 구성된 최종 배지(FM)를 준비합니다.
3. 시험관 내 4일 후 PM을 1-1.5mL CM으로 교체합니다(DIV). 6 DIV에서 CM의 50%를 새 CM으로 교체합니다. DIV 8에서 매체를 1.5mL FM으로 변경한 다음 2일마다 FM을 50% 변경합니다. 약 1주일 후에 자발적인 동기 활동이 나타납니다.

3. 형광 염료를 사용한 신경 배양에서 자발적 또는 유발 활동의 이미징.

1. 50μL DMSO(디메틸 설폭사이드)에 50μg 칼슘에 민감한 형광 염료(재료/시약 표 참조) 용액을 준비합니다.
2. 10 Hepes, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glucose, 45 sucrose (pH 7.4)를 함유하는 (mM 단위) 세포외 기록 용액(EM)을 제조합니다.
3. 칼슘에 민감한 형광 염료 용액 8μL와 함께 2mL EM에서 신경 세포 배양을 1시간 동안 배양합니다. 빛을 피하고 부드럽게 회전하여 염료가 세포에 균일하게 퍼질 수 있도록 합니다.
4. 이미징 전에 용액을 새 EM으로 교체하십시오. 형광 이미징은 그림 3에 나와 있습니다.
5. 칼슘 형광 이미징(488nm에서 여기 피크, 520nm에서 방출 피크)을 위한 광학 필터가 있는 형광 현미경의 이미지, 현미경의 시야 내에서 모든 관심 영역(ROI)의 강도를 정량화할 수 있는 카메라와 소프트웨어를 사용하여 이미지.

4. 배양의 자기 자극

참고: 자기 자극을 위한 기본 설정은 그림 1에 나와 있습니다. 오른쪽 상단에는 뉴런에서 칼슘에 민감한 염료를 이미지화하는 데 사용되는 도립 형광 현미경이 표시됩니다. 자기 코일(파란색 원)은 신경 고리 배양물(파란색 윤곽선)에서 동심원으로 약 5mm 위에 위치합니다. 페트리 접시의 둘레에 있는 픽업 코일(빨간색 원)은 자기 펄스에 의해 유도된 전압을 모니터링합니다. 왼쪽 상단에는 픽업 코일에서 통합된 5,000kV의 커패시터 전압 부하에서 측정된 자기 자극기(MS) 코일의 역학이 표시됩니다. 유도 전기장(고리 반경 14mm에 대해 계산됨)은 녹색으로 표시되고 자기장은 파란색으로 표시됩니다. 하단에는 신경 세포 배양의 이미지가 표시됩니다. 왼쪽 하단에는 패턴이 있는 24mm 커버슬립의 명시야 이미지가 있습니다. 흰색 영역은 뉴런입니다. 촬영된 패턴은 서로 다른 반지름을 가진 동심원 고리 문화로 구성됩니다. 오른쪽 하단에는 고리의 짧은 부분을 확대하여 개별 뉴런을 보여줍니다. 스케일의 경우 고리의 너비는 약 200μm입니다.

1. 1D 배양 자극을 위해 뉴런을 원형 고리 패턴(1.5에 설명된 대로 에칭)으로 성장시킵니다. 얇은(170μm), 긴(10mm) 선에 패턴화된 1D 배양을 사용하여 칼슘 이미징(섹션 3 참조)을 위해 칼슘에 민감한 형광 염료를 사용합니다.
   1. 원형 자기 코일을 사용하고 페트리 접시를 약 5mm 아래에 놓고 코일과 동심원으로 배치합니다. 30kV의 최대 전압으로 로드된 수제 또는 상업용 MS에 의해 구동되는 L = 90mH의 인덕턴스를 가진 약 5mm(내경, 46mm 외경) 코일의 맞춤형 코일을 사용합니다.
   2. 신경 세포 배양을 자기적으로 자극하기 위해 고전압과 전류가 고전류-고전압 스위치를 사용하여 전도성 코일을 통해 방전됩니다. 자기 자극기(MS)는 100mF 정도의 대형 커패시터를 사용하여 1 - 5kV의 고전압을 얻을 수 있습니다. 또는 시중에서 판매되는 MS(재료/시약 표 참조)를 사용하십시오.
      메모: 두께 0.254mm, 폭 6.35mm의 폴리에스터 코팅된 직사각형 구리선을 사용하여 수제 코일을 제작합니다. 유리 섬유로 절연된 맞춤형 프레임에서 와이어를 돌리고 에폭시로 주조합니다(재료/시약 표 참조). 또는 시판되는 코일을 사용하십시오(재료/시약 표 참조).

결과

그림 1: 뉴런 배양의 자기 자극에 사용되는 설정의 개략도. 에이. 상단에는 뉴런 고리 배양액에서 동심원으로 5mm 떨어진 곳에 위치한 자기 코일(파란색 원)이 페트리 접시(파란색 윤곽선)에 배치됩니다. 페트리 접시의 둘레에 위치한 픽업 코일(빨간색 원)은 자기 펄스에 의해 유도된 전압을 측정합니다. 하단에는 자기 자극기 코일의 측정된 역학이 픽업 코일에서 통합된 대로 표시됩니다(5,000kV의 MS 커패시터 전압 부하 사용). 유도 전기장(고리 반경 14mm에 대해 계산됨)은 녹색으로 표시되고 자기장은 파란색 B로 표시됩니다. 도립 현미경은 자기 펄스에 반응하는 뉴런의 칼슘 과도 현상에 민감한 형광 염료를 이미지화합니다. 다. 동심원 고리 패턴에서 자란 뉴런...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
칼슘2, 1M	플루카	21098	세포외 기록 솔루션
D-(+)-포도당, 1M	시그마-알드리치	65146	도금 매체, 세포외 기록 용액
디-PBS	시그마-알드리치	D8537	세포 배양
피브로넥틴	시그마-알드리치	F1141	바이오 코팅
플루오4, 오전	생명 기술	F14201	자발적이거나 유발된 활동의 이미징
피드르	시그마-알드리치	F0503	매체 변경
겐타마이신	시그마-알드리치	G1272 (영문	도금 매체, 매체 변경, 최종 매체.
헥스, 1M	시그마-알드리치	H0887	세포외 기록 솔루션
안녕 HS	비(BI)	04-124-1ᄀ	도금 매체, 변경 매체, 최종 매체
KCl, 3M	머 크	1049361000	세포외 기록 솔루션
라미닌	시그마-알드리치	엘2020	바이오 코팅.
MEM x 1	지브코	제21090-022	도금 매체, 변경 매체, 최종 매체
염화마그네슘, 1M	시그마-알드리치	M1028	세포외 기록 솔루션
염화나트륨, 4M	바이오 랩	19030591	세포외 기록 솔루션
옥타데카네티올	시그마-알드리치	1858	Cr-Au 코팅 커버슬립 세척(1D 배양물)
설탕, 1M	시그마-알드리치	S1888	세포외 기록 솔루션
우리딘	시그마-알드리치	U3750	매체 변경
스퍼터링 머신	AJA 인터내셔널, Inc	ATC 오리온-5 시리즈	얇은 금속 층으로 유리 코팅
펜 플로터	휴렛 팩커드	HP 7475A	코팅된 커버슬립에 패턴 에칭
전원 공급 장치	행렬	MPS-3005 LK-3	스퍼터링 기계에 전원 공급
에폭시	코그니스	버사미드 140	수제 코일의 주조
에폭시	포탄	에폰 815	수제 코일의 주조

년 ) 호 년 년