Multielectrode Arrays를 활용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리학을 측정합니다.

초록

출처: Cvetkovic, C., et al. 인간 만능 줄기 세포의 성상 세포 및 뉴런의 3D 공동 배양을 사용한 시냅스 미세 회로 모델링. J. Vis. 특급 (2018년)

이 비디오는 MEA(Multielectrode Array)를 사용하여 3D 공동 배양 구에서 시냅스 생리를 측정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 3D 구 내에서 신경망 역학 및 시냅스 네트워크 버스트 활동을 이해할 수 있습니다.

프로토콜

MEA(Multielectrode Arrays)를 사용한 실시간 시냅스 생리학 측정

1. 세포 배양을 위한 MEA를 준비합니다.

1. 각 MEA의 표면을 1mL의 세제로 1시간 동안 청소합니다. 멸균 탈이온수(DI)로 헹구고 70% 에탄올로 헹구어 살균한 다음 자외선이 차단된 생물 안전 캐비닛에서 자연 건조합니다.
   메모: MEA는 멸균 상태에서 4°C의 DI 워터에 사용할 때까지 보관할 수 있습니다.
2. 50mg의 PLO를 100mL의 붕산 완충액에 용해시켜 0.5mg/mL의 폴리오르니틴(PLO) 용액을 준비합니다. 각 MEA의 표면을 1mL의 PLO로 코팅하여 친수성을 만들고 37°C에서 최소 4시간 동안 배양합니다. PLO를 제거하고 DI 물로 표면을 씻으십시오.
3. ECM(extracellular matrix) 코팅 용액을 기저(DMEM/F12) 배지로 희석하여 1mg/mL 원액을 준비합니다. 작동하는 용액의 경우, 3mL의 ECM 스톡을 33mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 매체에 재현탁시켜 총 부피를 36mL로 만들고 80μg/mL의 농도를 만듭니다.
4. 각 MEA에 ECM 작업 용액 1mL를 추가하고 37°C에서 최소 4시간 동안 배양합니다.
5. ECM을 제거하고 MEA 표면의 1.5mL 매체에 구체를 배치하여 구체가 전극 어레이 위에 배치되도록 합니다(그림 1A, 1A'). 미디어가 2일 동안 부착되도록 합니다. 2-3일마다(또는 필요한 경우 더 자주) 미디어의 절반을 교체하여 구가 방해받지 않도록 합니다.
   메모: 성장 인자를 추가하면 배양 생존 및 성숙을 향상시킬 수 있습니다.

2. 신경 구체의 전기적 활동을 측정합니다.

1. 온도 제어 헤드스테이지가 있는 다전극 어레이(MEA) 시스템을 설정합니다. 5Hz 고역 통과 필터, 200Hz 저역 통과 필터 및 5x 표준 편차(SD)의 스파이크 임계값이 있는 소프트웨어 프로그램을 만듭니다.
2. MEA를 헤드스테이지에 놓고 자발적인 전기 활동을 기록합니다(그림 1B, B'). 통계 분석을 위해 스파이크 빈도 및 진폭을 포함한 원시 데이터를 저장합니다.
   메모: MEA와 함께 관류 시스템을 사용하여 약리제를 추가하거나 장기 기록을 위해 신선한 배지의 흐름을 증가시킬 수 있습니다. 필요에 따라, 스파이크의 추가적인 후처리가 수행될 수 있다.

결과

그림 1: 다전극 어레이(MEA)에서 신경 구체의 대표적인 살아있는 시냅스 생리학. (아, 아') MEA는 신경 구체의 실시간 시냅스 생리학을 측정하는 데 사용됩니다. iNeuron(A)의 구체 또는 iNeurons 및 hAstros(A')의 공동 배양은 ECM 모방 기판이 있는 MEA 표면에서 배양할 수 있습니다(4.1단계 참조). (B, B') 기록 창(수평 축) 동안 모든 전극(수직 축)에서 측정된 대표적인 자발적인 전기 활동의 래스터 플롯. 신경생리학적 기저 매체에서 4주간의 배양 후41, iNeuron 구체(B)는 자발적인 스파이크를 보인 반면, coculture 구체(B')는 동기 발사 패턴(주황색 화살표)의 증가된 네트워크 버스트를 보여주었습니다....

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	써모피셔	제10565-042	GlutaMAX 보충제 함유
안티/안티	써모피셔	15240062
나27	써모피셔	17504044	미디어 보충 자료
덤플링을	시그마	H3149-50구	작동 농도 : 2 mg / mL
Matrigel 멤브레인 매트릭스	코 닝	제354230	ECM 코팅 솔루션. 작업 농도 : 80 ug / ml. 얼음 위에서 준비하고 피펫, 튜브 및 미디어가 미리 냉각되었는지 확인하십시오.
MEA 2100 시스템	멀티채널 시스템	MEA2100
엔2	써모피셔	17502048	미디어 보충 자료
폴리-l-오르니틴(PLO)	시그마	P3655-100MG	작동 농도 : 0.5 mg / mL

호 호