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1. 이광자 레이저 현미경을 사용한 뉴런 부분모집단의 절제
참고: 사용자가 절제 후 Ca 이미징을 수행할 계획이라면 UAShspzGCaMP6s 라인을 사용하십시오. 사용자가 절제 후 행동 기록을 수행할 계획인 경우 EGFP 양성 세포의 절제가 GCaMP6s 발현 세포보다 수행하기 쉽기 때문에 UAS:EGFP 라인을 사용하십시오.
- 먼저 연구할 특정 뉴런과 UAS:EGFP 또는 UAShspzGCaMP6를 라벨링하는 Gal4 라인의 짝짓기를 설정합니다. 진주층 동형접합체를 얻을 수 있도록 양쪽 부모에 대해 진주층 배경을 사용해야 합니다.
메모: 진주층의 동형접합체(homozygotes)는 신체 표면에 멜라노포어(melanophores)를 포함하지 않습니다(그림 1B). 본 연구에서는 Gal4 라인 gSAIzGFFM119B(pretectum 라벨링) 및 다른 Gal4 라인 hspGFFDMC76A(ILH 라벨링)가 사용됩니다.
- 짝짓기 설정 다음 날, 제브라피시 알을 모아 관심 뉴런이 형광 리포터를 발현하는 유충 단계까지 키웁니다.
- 제브라피쉬 유충을 2% 저융점-아가로스에 장착합니다(그림 1B).
- 먼저 2% 아가로스 스톡 용액을 준비합니다: 저융점 아가로스 분말 2g을 100mL 시스템 물(즉, 순환 수계에서 성체 제브라피시를 유지하는 데 사용되는 물) 또는 E3 물에 전자레인지에서 물을 끓는점까지 가열하고 세게 혼합하여 용해합니다.
- 2%의 낮은 융점 아가로스 육수를 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 3.5-4.0mL의 아가로스를 6cm 페트리 접시 뚜껑에 붓습니다. 계속하기 전에 아가로스가 식을 때까지 기다렸다가 만졌을 때 따뜻해집니다.
- 다음으로, 한 마리의 유충(이 단계에서 마취되지 않음)을 아가로스에 놓습니다. 해부 바늘(그림 1C)을 사용하여 유충의 위치와 방향을 계속 조정하여 아가로스가 응고되어 유충의 적절한 위치를 보장할 때까지 똑바로 세웁니다.
메모: 유충은 아가로스가 굳어지는 동안 계속 헤엄칠 것입니다.
- 유충이 위치를 잡으면 아가로스가 완전히 굳을 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 아가로스 위에 트리카인 용액 5mL(0.4% 1회 작업 농도)를 붓습니다.
메모: 레이저 절제 중 유충의 움직임을 피하기 위해 유충은 절제 절차 내내 마취 상태를 유지해야 합니다.
- 이광자 레이저 현미경 시스템에서 표백 기능을 사용하여 유충을 제거합니다.
- 아가로스에 박힌 유충을 이광자 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 현미경 시스템을 시작합니다.
- 이미지 획득 소프트웨어를 시작하고 "레이저" 탭에서 "켜기" 버튼을 클릭하여 레이저를 켭니다(그림 1D). 레이저의 "상태"가 "사용 중"에서 "모드 잠금"으로 변경될 때까지 기다립니다.
- "채널" 탭에서 레이저의 파장을 EGFP 절제의 경우 880nm(최대 출력: 약 2,300mW)로 설정하거나 GCaMP 절제의 경우 800nm(최대 출력: 약 2,600mW)로 설정합니다.
- 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 20X 대물 렌즈를 선택합니다. "찾기" 탭을 클릭하고 "GFP"를 클릭하여 광학 경로를 변경하고 눈으로 형광을 직접 볼 수 있습니다.
- 시야 중앙에서 제브라피시 유충 뇌를 찾은 다음 "Acquisition" 탭을 클릭하여 이광자 현미경으로 돌아갑니다.
- '절제 전' 상태에 대한 기록으로 20X 대물 렌즈로 빠른 스캔 속도로 z-stack 이미지를 촬영합니다(열 손상 방지를 위해). 나중에 절제 실험 전후에 촬영한 이미지를 비교합니다(그림 2A). z-스택을 얻으려면 "Z-스택"을 클릭하여 z-stack 옵션을 선택하고 탭을 확장합니다. 애벌레 뇌의 복부 말단에 초점을 맞춘 후 하한선을 설정하고("Set First" 버튼 클릭), 뇌의 가장 등쪽 표면에 초점을 맞춘 후 상한을 설정합니다("Set Last" 버튼 클릭). 그런 다음 "실험 시작" 버튼을 클릭하여 z-stack 이미지 획득을 실행합니다.
- 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 63X 대물 렌즈를 선택합니다.
- "Locate(찾기)" 탭을 클릭하여 epi-fluorescent microscopy(에피 형광 현미경 검사)로 전환하고, 눈으로 볼 수 있는 중심에서 절제할 세포를 찾은 다음 "Acquisition(획득)" 탭을 클릭하여 레이저 스캐닝 현미경 검사로 돌아갑니다.
- "획득 모드" 탭에서 "프레임 크기"를 256 x 256으로 설정합니다. "Live"를 클릭하고 관심 있는 뉴런을 관찰합니다.
- 가장 등쪽에서 시작하여 절제할 세포가 초점이 맞춰진 초점면을 찾습니다.
- "Regions" 기능을 사용하여 각 뉴런에서 세포 지름의 약 1/3 크기의 작은 원형 영역을 관심 영역(ROI)으로 표시합니다.
- 스캔 속도를 13.93초/256 x 256픽셀(134.42μm x 134.42μm)로 설정하며, 이는 약 200μs/픽셀 또는 200μs/0.5μm의 레이저 체류 시간에 해당합니다. 또한 4회 반복을 설정합니다('반복 주기: 4'). 또는 반복 횟수와 스캔 속도를 최적화하여 충분한 절제를 달성할 수 있습니다.
- 절제를 위한 'Bleaching' 기능을 'Time series (2 cycles)'와 함께 수행하여 샘플(절제 전과 후)을 이미지화하고 'Regions'(ROI 설정) 또는 사용된 소프트웨어에서 이에 상응하는 기능을 이미징합니다(그림 1D).
- 시계열 주기에서 첫 번째 이미지(절제 전)와 두 번째 이미지(절제 후)를 비교하여 표백 후 표적 세포의 형광이 배경 수준에서 관찰된 형광으로 감소하는지 확인합니다(그림 2B).
- 절제 후에도 형광이 여전히 존재하면 반복 횟수를 늘리십시오.
- 다음으로, 초점면을 약간 더 깊숙이(즉, 복부 쪽으로) 이동하고 절제되지 않은 세포가 나타나는 다음 초점면을 선택합니다.
- 위에서 설명한 대로 표백 기능을 수행합니다(1.9단계). 관심 신경 구조의 모든 세포가 절제될 때까지 이 단계를 반복합니다.
- 절제할 신경 구조를 덮고 있는 모든 초점면을 통과한 후 세포에 형광이 제거되었는지 확인합니다. 불충분한 절제로 인해 일부 세포가 여전히 형광을 발하는 것으로 확인되면 위에서 설명한 대로 다시 레이저를 조사합니다.
- 레이저 조사 후 아가로스에서 유충을 회수해야 하는 경우 유충을 손상시킬 수 있으므로 아가로스에서 강제로 빼내려고 하지 마십시오. 대신, 유충 주위의 아가로스를 몸 표면에 수직으로 조심스럽게 작게 자릅니다. 그런 다음 마취제가 사라지면 유충이 스스로 아가로스에서 헤엄쳐 나올 때까지 기다립니다.
- 절제를 위해 다음 유충으로 진행하거나 조사 중인 행동에 관여하지 않은 다른 뉴런 집단을 사용하여 대조 실험을 수행합니다.
메모: 여기서, 대조군으로서, UAS의 후각구 뉴런:EGFP; gSAIzGFFM119B 유충은 위에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 레이저 절제되었습니다(그림 2A, 오른쪽).
- Ca 이미징(섹션 2) 또는 행동 기록(섹션 3)을 진행하기 전에 회복을 위해 몇 시간 또는 1일을 기다립니다. 이 회복 시간 동안 유충의 건강 상태(즉, 정상적인 자연 수영, 절제 부위 주변에 명백한 열 손상 없음 등)를 확인하고 건강 악화의 징후를 보이는 유충을 제거합니다.
2. pretectum-ablated 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 신경 세포 활동을 기록하기 위한 칼슘 이미징
- 기록 챔버를 준비하려면 접착면이 유리를 향하도록 유리 슬라이드에 안전 밀봉 혼성화 챔버 개스킷을 놓고 상단 밀봉을 제거합니다.
메모: 이렇게 하면 직경이 9mm이고 깊이가 0.8mm인 작은 기록 챔버가 생성됩니다(그림 3A).
- 다음으로, 바닥 절단부가 열린 50mL 튜브에 나일론 메쉬(개구부 크기: 32μm)를 놓습니다. 캡을 사용하여 튜브에 메쉬를 부착합니다(그림 3B).
- paramecia (유충의 시각적 자극으로 사용되는 먹이)를 준비합니다.
메모: 사전에 Paramecium 배양(2.3.1 및 2.3.2 단계)을 준비합니다.
- 사전에 상업적 출처 또는 학술 생물 자원 센터에서 paramecia 종자 배양을 얻으십시오.
- 파라메슘을 고압멸균된 볏짚과 건조 맥주 효모 펠릿이 포함된 물에서 며칠 동안 배양합니다(그림 3C).
- 파라메슘 배양물을 2개의 체(하나는 150μm 조리개, 다른 하나는 75μm 조리개)를 통해 연속적으로 주입하여 배양물에서 파편을 제거합니다.
- 이전 단계의 플로우 스루에서 나일론 메쉬(13μm 조리개)에 파라메시아를 수집합니다.
- 시스템 물 짜기 병을 사용하여 나일론 메쉬의 paramecia를 유리 비커에 다시 매달아 놓습니다(그림 3D).
- 메쉬(그림 3B)를 시스템 물 2x(그림 3E)로 헹굽니다.
메모: 본 연구의 목적은 시각적으로 유도되는 뉴런 활동을 관찰하는 것이므로 파라메슘 배양 배지에 포함된 가능한 모든 냄새 물질과 타스탄트를 제거하는 것입니다.
- 제브라피시 유충을 트리카인 용액에 넣어 마취합니다.
- 2%가 낮은 융점 아가로스에 단일 유충을 장착합니다.
- 먼저, 2% 낮은 융점 아가로스를 전자레인지에 넣고 10배 농축 트리카인 1/10 부피를 아가로스에 첨가합니다.
- 트리카인이 함유된 아가로스 한 방울을 기록 챔버에 떨어뜨립니다(그림 3A).
- 아가로스가 너무 뜨겁지 않다는 것을 확인한 후, 마취된 유충(2.5단계에서)을 아가로스에 넣고 여분의 아가로스를 즉시 제거하여 아가로스 표면이 약간 볼록하게 보이도록 합니다.
- 해부 바늘을 사용하여 유충을 빠르게 직립 위치로 향하게 합니다(그림 1C).
메모: 이러한 절차는 아가로스가 응고되기 몇 초 전에 완료되어야 합니다.
- 유충이 적절한 위치에 놓이면 아가로스가 완전히 굳을 때까지 5분 동안 기다립니다. 그런 다음 아가로스에 1x 트리카인 용액 한 방울을 붓습니다.
- 제브라피쉬 유충의 머리 주위의 아가로스를 제거하고 파라메시움이 수술용 칼을 사용하여 수영할 수 있는 공간을 만듭니다. 이렇게 하려면 먼저 아가로스를 몇 개 작게 자릅니다(그림 3F). 그런 다음 챔버에 시스템 물을 부드럽게 부어 여분의 아가로스를 조심스럽게 제거합니다.
메모: 이 단계에서 트리카인은 씻겨 나갑니다.
- 다음으로, 시각적 자극 역할을 하기 위해 기록 챔버에 하나의 파라메시움을 놓습니다.
메모: 파라메슘이 제브라피시 유충의 머리 근처에서 수영할 때, 그것은 신경 반응을 일으킬 것입니다(그림 3G).
- 과학적인 CMOS 카메라가 장착된 에피 형광 현미경(그림 3H) 아래에 기록 챔버를 놓고 2.5X 대물 렌즈(그림 3I)를 선택합니다.
- GCaMP 형광 신호의 타임랩스 기록을 수집합니다.
- 장착된 카메라에 대한 이미지 획득 애플리케이션을 시작합니다.
- "Sequence Pane"을 클릭하고 창에서 "Hard Disk Record"를 선택합니다. 스캔 설정 섹션에서 "프레임 수"를 900 또는 원하는 다른 총 프레임 수로 설정합니다.
메모: 가능한 경우 데이터를 하드 드라이브에 효율적으로 저장할 수 있는 모듈(여기서는 "하드 디스크 기록")과 함께 타임랩스 녹화 소프트웨어를 사용하십시오.
- "Capture(캡처)" 창에서 노출 시간을 30ms(즉, 33.3fps)로 설정하고 Binning 2 x 2로 설정합니다.
- GCaMP가 GFP와 유사한 여기/방출 스펙트럼을 가지므로 현미경 제어 터치 패널에서 GFP용 필터 세트를 선택합니다.
- 캡처 창에서 "Live"를 클릭하여 카메라 뷰와 초점에서 유충을 찾은 다음(그림 4A) "Stop Live"를 클릭하고 "Start" 버튼을 클릭합니다. 동영상을 .cxd 또는 획득 조건에 대한 정보가 들어 있는 다른 형식으로 저장합니다.
