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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 전기생리학
참고: 이 프로토콜의 목표는 GFP 전기천공된 마우스 뇌(또는 이전에 전기천공된 다른 형광 단백질)에서 GFP 발현에 의해 시각적으로 식별된 레이어 II/III 피라미드 세포 뉴런에서 전체 세포 전류 클램프 기록을 얻는 것입니다. 이 프로토콜을 사용하면 IUE에 의해 도입된 유전자 변형이 뉴런의 전기적 특성에 미치는 영향을 연구할 수 있습니다. 특정 발사 모드의 획득은 광범위한 이온 채널 레퍼토리의 동적 발현을 포함하는 점진적인 분화 과정이며, 그 결과 출생 후 후기 단계 전에 일시적인 발사 모드가 발현됩니다. 예를 들어, P16 이전의 체성 감각 마우스 피질의 II/III층에서는 성숙한 전기 반응이 관찰되지 않습니다.
- 급성 슬라이스에 대한 사전 요구 사항
- 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM 포도당, 2.5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2 및 1 mM NaH2PO4를 포함하는 고순도 (이중 증류수)를 사용하여 ACSF 1L를 준비합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.3 - 7.4로 적정합니다. 삼투압을 290mOsm으로 조정합니다.
- pH를 7.3 - 7.4로 안정화하기 위해 테프론 튜브(~ 1mm)를 사용하여 15 - 20분 동안 탄수화물(95% O2/5% CO2)로 ACSF를 거품화합니다.
- 전체 셀 기록을 위한 전제 조건
- 전기생리학 스테이션에 기록 챔버, 관류 시스템, 현미경, 전극(기록, 자극 및 접지), 매크로 및 마이크로 매니퓰레이터, 견고한 진동 방지 탁상용 및 패러데이 케이지, 자극기, 증폭기 및 아날로그-디지털(A/D) 변환기, 수집 소프트웨어가 있는 컴퓨터, 유전자 변형 뉴런을 분석하기 위한 GFP(또는 기타 형광 색소) 필터가 장착되어 있는지 확인합니다(그림 1A).
- 115mM 글루콘산칼륨, 2mM MgCl2, 10mM Hepes, 20mM KCl, 4mM Na2ATP 및 0.3mM Na3GTP를 함유하는 세포내 용액을 KOH에 의해 pH 7.2 및 KCl에 의해 290mOsm으로 조정했습니다.
- 붕규산 유리 모세관을 당겨 패치 피펫을 만듭니다. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 패치 전극을 준비합니다. 붕규산 모세관(외경 1.5mm, 내경 0.86mm, 길이 10cm)을 사용합니다. 세포 내 용액으로 채워질 때 3-10MΩ의 저항을 보여주는 패치 전극을 만듭니다.
- ACSF로 기록 챔버를 2mL/분의 속도로 관류합니다. 챔버의 온도를 약 33°C로 유지합니다.
- 전체 세포 기록
- 파스퇴르 피펫(긴 끝을 잘라냄) 또는 작은 브러시를 사용하여 슬라이스를 기록 챔버로 옮깁니다. 하프로 슬라이스를 누릅니다. 2mL/분의 속도로 ACSF로 슬라이스를 지속적으로 관류합니다.
- GFP 양성 뉴런을 패치합니다.
- 슬라이스를 기록실에 넣고 저배율(10X)로 현미경을 통해 관심 영역을 찾습니다. 그런 다음 60x 대물렌즈를 사용하여 패치할 GFP 양성 셀을 찾습니다.
- 기록 전극을 세포 내 용액으로 채웁니다. 필터(4mm 필터)와 마이크로 로더 팁에 연결된 주사기를 사용하여 기록 전극을 세포 내 용액으로 채웁니다.
- 유리 피펫을 피펫 홀더에 놓습니다. 피펫 팁을 수조에 넣고 팁에 초점을 맞춥니다. 피펫이 수조에 들어가면 배압 제어 시스템을 통해 양압을 가합니다.
- 형광 뉴런을 패치합니다(그림 1B).
- 시각적 안내에 따라 관심 세포에 접근하는 동시에 파이펫의 배압을 유지합니다. 세포 표면에 작은 보조개가 나타나면 압력을 해제하십시오. 이 시점에서 단단한 밀봉(1GΩ보다 큰 저항)이 형성될 수 있습니다. 그렇지 않으면 가벼운 음압 (흡입)을 가하여 용이하게하십시오.
- 씰이 형성되는 동안 유지 전압 클램프를 -60mV로 가져옵니다. GΩ 씰이 형성되면 흡입 펄스를 적용하여 피펫 아래의 세포막을 파열하고 전체 세포 모드로 전환합니다.
- 전류 클램프 조건을 사용하여 활동을 기록합니다. 전체 셀 모드에 들어가면 전압 클램프에서 전류 클램프 모드로 전환하고 녹음을 시작합니다. 예를 들어, 세포 여기성을 기록하려면 500ms 길이의 탈분극 전류 주입(100 - 400pA)을 적용합니다.
- 입력 전류를 증가시키기 위해 열차를 따라 활동 전위의 수를 플로팅하여 발사 속도를 계산합니다.
메모: 휴지 멤브레인 전위, 입력 저항 및 멤브레인 커패시턴스도 기록으로부터 계산될 수 있습니다.
