Measuring Brain Glutamate Levels in Anesthesia in Neonatal Piglets Using a Microelectrode Array(미세전극 어레이를 사용한 신생아 새끼 돼지의 마취 하에서 뇌 글루타메이트 수치 측정)

초록

출처: Geyer, E. D., et al. 온전한 새끼 돼지 뇌의 마취 유발 신경독성 연구를 위한 미세 전극 어레이 기술의 적응. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 미세전극배열(MEA)을 사용하여 마취된 신생아 새끼 돼지의 뇌 내 글루타메이트 수치를 측정하는 방법을 보여줍니다. 이 시술에는 돼지 두개골에 개두창을 만들고 MEA를 관심 뇌 영역에 삽입하는 것이 포함됩니다. MEA의 글루타메이트 산화효소로 코팅된 기록 부위는 세포외 뇌 글루타메이트를 과산화수소로 변환하여 측정 가능한 전류를 생성합니다. 이 전류는 마취 상태에서 뇌의 글루타메이트 수치를 결정하기 위해 배경 소음에 대해 측정되고 정규화됩니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 새끼 돼지 및 새끼 돼지 취급

1. ARRIVE 지침에 따라 잠재적인 성별 기반 교란 요인을 제거하기 위해 체계적이고 무작위적인 방식으로 수컷 및 암컷 새끼 돼지를 활용합니다.
   참고: 최대 뇌 성장 기간은 새끼 돼지 출생 후 3-5일 이내이기 때문에 실험은 생후 3-5일 된 새끼 돼지로만 수행됩니다.
2. 환경에 적응할 수 있도록 새끼 돼지가 실험 최소 24시간 전에 사육장에 도착하도록 합니다.
   메모: 훈련된 수의사가 일상적인 동물 관리를 제공합니다. 새끼 돼지는 개별적으로 온도가 유지되고 지속적으로 모니터링되는 케이지에 보관되며 저혈당증을 예방하기 위해 영양학적으로 완전한 우유 대체제를 즉시 받습니다. 새끼 돼지는 또한 마취 전 최소 3시간 동안 우유 대용 없이(nol per os) 사육되며 정상적인 수준의 자극을 보장하기 위해 담요와 장난감이 제공됩니다. 가능하면 사회화가 가능하도록 여러 새끼 돼지를 같은 우리에 보관하십시오.

2. 새끼 돼지 모델에서 마취 유도 신경 독성(AIN) 연구를 위한 미세 전극 어레이(MEA)의 개발 및 맞춤화

참고: 이 기술은 효소로 사전 코팅되고 m-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(mPD)로 전기 도금된 효소 기반 MEA를 사용합니다. 전극은 40mm 강성 샤프트로 맞춤 설계되었으며 새끼 돼지에 사용하도록 제조되었습니다(그림 1).

1. MEA 준비 및 보정에 대한 자세한 설명을 참조하십시오(그림 2).

3. 새끼 돼지를 위한 마취 및 맞춤형 입체 기구 사용

1. 적절한 인공호흡기 및 모니터링 장치가 있는 마취 워크스테이션을 사용하여 동물을 마취하고 앞서 설명한 대로 실험 전반에 걸쳐 맥박 산소 측정, 비침습적 혈압, 심전도 및 체온과 같은 생리학적 매개변수를 모니터링합니다. 새끼 돼지를 삽관 및 인공호흡하고 3.5시간 동안 최소 1개의 폐포 농도(MAC)(약 2.5-3%)에서 세보플루란 마취를 시행합니다. 이러한 실험에는 훈련된 실험실 직원이 동석해야 합니다. 피부를 준비하기 전에 전기 이발기를 사용하여 수술 부위의 털을 제거합니다.
   메모: 사용된 마취제의 농도와 지속 시간을 통해 실험은 수술 절차 중 실제 마취 노출의 시간 길이를 시뮬레이션할 수 있습니다. 또한, 세보플루란은 소아 인구에서 가장 일반적으로 사용되는 전신 마취제이기 때문에 그 안전성을 둘러싼 조사가 가장 중요합니다.
2. 입체성 프레임에 배치하기 전에 프레임에 고정된 동안 동물의 움직임을 방지하기 위해 2.5mg/kg의 로쿠로늄 로딩 용량과 1.5mg/kg/h의 주입을 시작합니다.
   1. 발가락 꼬집기로 적절한 마취 깊이가 확인되면 새끼 돼지 특정 입위 프레임에 새끼 돼지를 놓습니다.
   2. 욕창을 방지하기 위해 추가 패딩(예: 유동화 포지셔너)이 있는 강제 공기 가온 패드에 새끼 돼지를 올려 입체성 프레임 내에 적절한 패딩을 제공합니다.
   3. 상악골의 치아를 치아 막대 위에 놓습니다(그림 3).
      메모: 치아 막대는 두개골을 제자리에 매우 단단히 고정할 수 있을 만큼 충분한 높이에 있어야 합니다.
   4. 귀 안쪽의 관통하는 이어바를 고정하고 조이면서 새끼 돼지가 정중선 위치에 있도록 주의하십시오. 측면 홀드의 뾰족한 끝을 외이도 내에 배치하고 고막의 침투와 관련된 "팝" 소리를 들을 수 있을 만큼 이어바를 단단히 삽입합니다. 이어바를 두개골에 단단히 부착하고 실험 중 두개골이 움직이지 않도록 양쪽에 동일한 깊이로 삽입하십시오(그림 4, 패널 A).
      메모: 새끼 돼지를 따뜻하게 유지하고(~ 37.8-38.6 °C) 정상혈증 유지를 위한 전체 절차 동안 온도를 지속적으로 모니터링하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 담요 및/또는 열 램프를 통해 수행할 수 있습니다. 동물의 피부가 타지 않도록 적절한 거리에 열 램프를 배치하십시오.
3. 두개골을 따라 4-6cm의 정중선 절개를 만들고 메스로 두개골에 자국을 남기지 않도록 주의하십시오. 절개가 이루어지면 부드럽게 수축시키고 둔기로 절개하여 두개골에서 두피를 들어 올립니다. 거즈 패드로 두개골을 부드럽게 문질러 결합 조직을 제거하고 봉합선을 노출시킵니다(그림 4, 패널 B).
   메모: 비생존 실험 중에는 무균 상태를 유지할 필요가 없습니다. 그러나 생존 실험 중에는 불임 상태를 유지해야 합니다.
4. 필요한 경우 두피를 추가로 반사하여 관심 영역을 노출시키고 개두술의 의도된 위치를 결정합니다(그림 5, 패널 A). 수술용 드릴을 사용하여 경막 또는 기저 뇌를 손상시키지 않도록 주의하면서 관심 구조 위에 약 0.25cm2(실험 목표에 따라 더 크거나 작을 수 있음)의 개두창을 만듭니다(그림 5, 패널 B). 미세한 수술용 가위를 사용하여 뇌 조직 위에 있는 경막을 절제합니다(그림 5, 패널 C).
5. 헤드스테이지의 금속 암을 새끼 돼지 입체의 미세 조작기에 고정하여 브레그마 위에 전극을 가능한 한 수직으로 배치합니다. 두개골 표면에 닿지 않도록 전극을 최대한 내립니다. 브레그마의 좌표를 기록합니다(그림 6, 패널 A).
   1. 전방-후방 및 내측 좌표와 브레그마와 관련된 관심 구조의 깊이를 결정합니다. species 및 age-appropriate stereotaxic atlas를 사용하여 입체택시 좌표를 결정합니다. 이 경우 새끼 돼지를 위해 특별히 개발된 입체 아틀라스를 사용합니다.
   2. 전극이 적절한 전방-후방 및 내측 위치를 갖도록 전극을 재배치하여 미세 전극과 장치가 모두 표면에 수직이 되도록 합니다. 의사 참조 전극을 두피 아래에 놓고 동물과 접촉하도록 합니다(그림 6, 패널 B).
   3. 천천히 그리고 부드럽게 정위 팔을 사용하여 전극을 뇌 깊숙이 적절한 깊이로 내립니다. 마지막 2mm의 경우 유압 마이크로 드라이브를 사용하여 전극을 정확한 위치로 추가로 구동합니다(그림 6, 패널 C).
      메모: 전극 위치는 개두창 위에 있어야 합니다. 전극 깊이는 관심 있는 뇌 구조에 따라 달라집니다. 비생존 실험에서 데이터 수집이 완료되면 절개 부위를 닫을 필요가 없습니다.

4. Sevoflurane 마취 하에서 세포외 글루타메이트 측정

1. 새끼 돼지가 이 절차 전반에 걸쳐 지속적인 생리학적 모니터링을 받고 있는지 확인하십시오. 새끼 돼지는 시술을 준비하기 위해 흡입으로(얼굴 원뿔을 통해) 마취됩니다.
2. MEA를 이식한 후 전극이 기준선에 도달할 때까지 30분 동안 기다렸다가 3시간 동안 올바른 측정값을 얻을 수 있도록 합니다(그림 7).
3. 수술 부위에 0.25% 부피바카인(1mL/kg)을 피하투여하여 수술 후 통증 관리를 실시합니다. 또한, 서방형 부프레노르핀은 필요에 따라 q72h를 피하로 투여합니다.

결과

그림 1: SG-2 미세전극 어레이 유형의 시각적 비교. SG-2 어레이에는 2개의 글루타메이트 민감 부위와 2개의 글루타메이트에 민감하지 않은 센티넬 부위(부위당 150μm x 20μm)가 포함되어 있습니다. (A) 플렉시블 샤프트 미세 전극 어레이가 왼쪽에 표시됩니다. 강성 샤프트 미세 전극 어레이는 새끼 돼지에 사용하도록 맞춤 설계되었으며 대형 동물에 더 깊은 이식을 허용합니다.

그림 2: microelectrode array 준비 및 보정 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Advance Liqui-Wean 돼지 우유 대체제	PBS 동물 건강
Piglet 마취 페이스콘 마스크	베트핍
Integra SL 마취 워크스테이션	DRE 수의학		이 마취 워크스테이션은 수술실에서 소아 환자가 경험하는 임상 모니터링을 가장 잘 모방하기 위해 선택되었습니다. 모든 마취 기계는 충분한 생리학적 모니터링 및 개입이 가능한 한 사용할 수 있습니다.
세보플루란	울테인	TEL.0074-4456-04
Rocuronium 브로마이드 주입	호스피라	TEL:0409-9558-05
Medfusion 4000 IV 주입	스미스 메디컬
모델 1530 헤비 듀티 리서치 모델 스테레오탁스	코프		맞춤 제작
모델 1541 Piglet 어댑터	코프		맞춤 제작
적외선 스폿 램프	아마존	B000HHQ94C
Bair Hugger 토르소 블랭킷	3엠	540
베어 허거	3엠	750
멸균 알코올 준비 패드	피셔브랜드	전화: 22-363-750
탄소강 리브 백 수술 잎	바드 파커	#10
메스 헨델	하벨의	한-G4
외과 용 가위	세계적인 정밀 기기	504615
모기 집게	Sklar 수술 기구	17-1225
거즈 패드	피셔브랜드	Tel.22-246-069
Adson 조직 겸자	텔레플렉스	181223
Dremel 111 인그레이빙 커터	아마존	드레멜 111
Microelectrode Array (미세전극 어레이	켄터키 대학교 Microelectrdoe 기술 센터		S2 4Ch MEA; 맞춤형
헤드스테이지	콴테온		2pA/mV
와이어, 은색, PFA, .008" 베어, .0110" 코팅	A-M 시스템	786500
미세 미세 조작기	나리시게 과학기구 연구실	미주리-8

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