투과 미세전극 어레이를 사용하여 펼쳐진 해마 조직의 신경 활동을 기록합니다.

초록

출처: Zhang, M., et al. 관통 마이크로 전극 어레이를 사용한 펼쳐진 해마 제제에서의 신경 활동 전파. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 펼쳐진 해마에서 신경 신호를 캡처하기 위해 PMEA(Penetrating Microelectrode Array)가 있는 기록 챔버를 설정하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 체외에서 펼쳐진 해마 내에서 신경 활동의 전파 속도와 방향을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 수술 및 실험 기록을 위한 솔루션

1. NaCl(염화나트륨) 124, KCl(염화칼륨) 3.75, KH₂PO₄(인산이수소칼륨) 1.25, MgSO₄(황산마그네슘) 2, NaHCO₃(중탄산나트륨) 26, 포도당 10 및 CaCl₂(염화칼슘) 2를 포함하는 일반 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액을 준비합니다. 이 정상 aCSF를 해부 후 조직 회수 및 실험 시작 시 세척 시스템에 사용하십시오.
2. 해마 해부 시 사용되며 (mM)을 함유하는 자당 aCSF를 준비합니다: 자당 220, KCl 2.95, NaH₂PO_{4 (}인산 이수소나트륨) 1.3, MgSO₄ 2, NaHCO₃ 26, 포도당 10 및 CaCl₂ 2. 온전한 해마 조직 제제에서 간질 활성을 유도하기 위해 100μM 농도의 정상 aCSF에 4-아미노피리딘(4-AP)을 첨가합니다.

2. 펼쳐진 해마를 투과 미세전극 배열(PMEA)에 배치하여 신경 활동을 기록합니다.

1. 실험 설정을 준비하기 위해 한 병에는 일반 aCSF를 채우고 다른 병에는 4-AP aCSF를 채웁니다. 두 병 모두에서 각 실험이 시작될 때부터 95% O₂/ 5% CO₂ 거품을 일으킵니다. 트라이 밸브 커넥터를 사용하여 실험 중에 선택할 솔루션을 제어합니다. 챔버 배출구에 진공관을 연결하여 용액을 먼지통에 펌핑합니다. 파이프라인을 레코딩 챔버로 전달하기 전에 가열하고 용액을 제어된 온도 수준(35°C)으로 유지합니다.
2. 기록 챔버의 입구와 출구가 닫히면 맞춤형 유리 피펫 스포이드를 사용하여 펼쳐진 해마를 챔버 내부로 옮기고 배치합니다. 현미경 아래에서 조직이 용액에 떠 있는 동안 일반 작은 페인트 브러시를 사용하여 펼쳐진 해마를 배치합니다. 펼친 해마를 폐포 쪽이 아래를 향하도록 하고, CA3 영역이 반대쪽을 가리키고, CA1 영역이 연구원을 가리키도록 배치합니다.
3. 기록 챔버의 가장자리에서 진공 피펫을 사용하여 챔버의 용액을 조심스럽게 빨아들여 챔버가 건조되고 조직이 어레이 위로 내려갈 때까지 용액 수준을 낮춥니다. 그런 다음 조직 위에 맞춤형 조직 앵커(그림 1)(특정 재료 및 장비의 번호 7)를 조심스럽게 배치하여 펼쳐진 해마를 어레이에 고정합니다. 용액 몇 방울을 기록 챔버에 떨어뜨려 다시 채우고 입구와 출구를 서서히 열어 IV 드립 챔버에서 초당 약 2방울로 유속을 조정합니다.
4. 회복을 위해 약 1분 동안 정상 aCSF로 기록 챔버의 조직을 배양한 다음 용액 공급을 4-AP 용존 aCSF로 전환하고 유속을 적절하게 조정합니다. 조직을 4-AP에 용해된 aCSF에 약 5-10분 동안 배양한 다음 연구원은 자발적인 활동이 나타날 때 신호를 기록하는 소프트웨어를 시작할 수 있습니다.

결과

그림 1. 실험적 설정. (A) 나사가 있는 플라스틱 덮개 덮개를 회로 위에 놓아 가능한 물 손상으로부터 보호합니다. 기록 챔버에는 용액 흐름을 운반하기 위해 입구 튜브와 출구 튜브가 모두 있습니다. 나일론 섬유 메쉬로 접착된 맞춤형 조직 앵커는 실험 중에 조직을 고정하는 데 사용됩니다. (B) 실험 중 샘플 슬라이스를 잡고 있는 조직 앵커를 보여주는 PMEA의 유리 기판 바닥에서 찍은 사진. 구부러진 와이어는 조직 위를 누르는 메쉬의 나일론 섬유입니다. 둥근 점은 미세 전극의 기초입니다. 화살표는 여러 실험 후에 손상된 전극을 가리킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
작은 페인트 브러시	로우스	tem # : 105657 모델 # : 90219	일반 페인트 브러시 패키지에서 가장 작은 크기를 가진 것
화재 광택 유리 도움말 도구	해당 사항 없음	해당 사항 없음	이 도구는 화재 광택 처리되어 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.
맞춤형 유리 바늘	해당 사항 없음	해당 사항 없음	이 도구는 화재 광택 처리되어 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.
금속 와이어 루프가 있는 맞춤형 유리 도구	해당 사항 없음	해당 사항 없음	이 도구는 화재 광택 처리되었으며 모양이 변경된 금속 와이어 루프가 있는 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.
맞춤형 유리 용액 스포이드	해당 사항 없음	해당 사항 없음	이 도구는 팁이 절단되고 절단 된 끝부분에 고무 헤드가 부착 된 일반 파스퇴르 유리 피펫으로 만들어졌습니다.
맞춤형 조직 앵커	해당 사항 없음	해당 사항 없음	나일론 섬유 메쉬는 절연 구리 와이어 링에 접착되었습니다. 조직 앵커는 미세 조작기에 의해 유지되었습니다.
맞춤형으로 제작된 미세전극 어레이	해당 사항 없음	해당 사항 없음	어레이에 대한 자세한 내용은 Kibler, et al, 2011을 참조하십시오.
어레이를 위한 맞춤형 필터 및 증폭기 회로	해당 사항 없음	해당 사항 없음	어레이에 대한 자세한 내용은 Kibler, et al, 2011을 참조하십시오.
데이터 수집 프로세서 3400a	마이크로스타 연구소	해당 사항 없음	이것은 A/D 변환기가 있는 완전한 데이터 수집 시스템입니다.