전기생리학 설정을 사용하여 시각적 경로 무결성을 평가하기 위한 RAT 모델 준비

초록

출처: Nguyen, C. T. et al., 마취된 쥐에서 전기 망막 검사 및 시각적 유발 전위의 동시 기록.J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 망막 건강과 시력 경로 무결성을 연구하기 위한 쥐 모델의 준비를 보여줍니다. 시각적 유발 전위 및 전기 망막검사 참조 및 활성 전극을 쥐에 연결한 다음, 고르게 망막 조명을 위해 플랫폼을 Ganzfeld 그릇 앞의 쥐와 정렬하고 외부 간섭을 피하기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 만성 VEP(Visual Evoked Potential) 전극의 이식 전

참고: 동시 망막전도(ERG) 및 VEP 신호를 수집해야 하는 경우 신호 수집 최소 1주일 전에 동물에게 VEP 전극을 외과적으로 이식해야 합니다.

1. 클로르헥시딘(70% 에탄올 중 0.5%)으로 세척하여 실험 전에 수술 벤치를 살균합니다. 사용하기 전에 모든 수술 장비를 오토클레이브하십시오. 멸균된 수술용 드레이프로 동물을 덮으십시오. 모든 실험자가 수술용 마스크, 가운 및 멸균된 장갑을 착용하도록 합니다.
2. 3 - 3.5% 이소플루란과 O₂를 3 L/min의 유속으로 마취를 유도합니다.수술 내내 1.5% 및 2L/min으로 마취를 유지합니다. 발 꼬집음 반사가 없어 충분한 마취 깊이를 확보하십시오.
3. 눈의 건조를 방지하기 위해 각막에 1% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 바르십시오.
4. 이마, 눈 뒤쪽, 귀 앞쪽을 30mm x 30mm 크기로 면도합니다.
5. 동물을 열 패드(37°C)에 올려 체온을 유지하고 입체 프레임으로 동물의 머리를 안정시킵니다.
6. 면도한 부위를 10% 포비돈 요오드로 3회 소독합니다. 눈 근처 부위의 경우 외과 기술자 협회(Association of Surgical Technologists)에서 정한 실행 표준에 따라 알코올 기반 소독제의 사용을 피하십시오.
7. 메스로 머리를 정중-시상으로 절개하고 이 절제에서 직경 ~ 20mm의 피부 조직을 원형으로 만들어 두개골을 노출시킵니다.
8. 거즈로 긁어내고 건조시켜 관상골 및 시상 두개골 봉합사를 노출시켜 밑에 있는 골막을 제거합니다.
9. 드릴에 부착된 치과용 버를 사용하여 입체 좌표(꼬리에서 브레그마까지 7mm, 옆에서 정중선까지 3mm)에서 양쪽 반구의 두개골을 통해 두 개의 구멍(직경 0.7mm, 깊이 ~ 1mm)을 트레판합니다.
10. 스테인리스 스틸 나사(직경 0.7mm, 길이 3mm, 클로르헥시딘으로 멸균)를 미리 만들어진 두 개의 구멍에 최대 ~ 1mm(나사 노출 2mm)까지 나사로 조여 단단히 고정할 수 있습니다. 이것은 기저에 있는 피질 조직을 손상시키지 않고 경막과 접촉합니다.
11. 거즈로 두개골을 건조시키고 ~ 4시와 8시 방향에 두 번의 3-0 봉합사로 늘어진 피부를 수축시켜 치아 아말감의 수술 부위를 준비합니다.
12. 노출된 두개골 위에 치과용 아말감을 펴서 나사 전극(1.10단계에서 설명한 스테인리스강 나사)을 제자리에 고정합니다. 녹음을 위해 나사의 ~ 1.5mm가 노출되어 있는지 확인합니다.
13. 후퇴 봉합사를 제거합니다.
14. 진통제는 0.5% 카프로펜(5mg/kg)을 피하주사하고 식염수(염화나트륨 0.9%, 1.5ml)는 수액 대체를 위해 피하주사합니다.
15. 동물들이 별도의 우리에서 회복할 수 있도록 합니다. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오.
16. 수술 후 완전히 회복될 때까지(최소 5일) 동물을 다른 동물과 함께 반납하지 마십시오.
17. 진통제를 위해 0.5% 카프로펜(5mg/kg)을 4일 동안 하루에 한 번 피하주사로 계속 투여합니다.
18. 수술 1주일 후 ERG 및 VEP를 기록합니다.

2. ERG 및 VEP 레코딩

1. 데이터 수집 준비
   1. 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 아래 권장 설정에 따라 자극을 동시에 트리거하고 데이터를 수집합니다.
      1. 절연 프리에 의해 내부적으로 설정된 게인으로 신호(ERG: ×1,000, VEP: x10,000)를 증폭합니다.ampliifier 및 ampliifier, 임피던스에 대해 일치하는 양쪽 눈으로 신호(ERG: 1,000, VEP: x10,000).
      2. 650msec 기록 창(2,560포인트)에서 ERG의 샘플링 속도를 4kHz로 설정하고, 이렇게 하려면 데이터 수집 소프트웨어에서 "시간축" 탭을 클릭하고(소프트웨어 이름 및 버전은 재료 표 참조), 샘플에 대해 "2,560"을 선택하고, 650msec 기록 창을 반환하는 시간에 대해 "500ms"를 선택합니다.
         1. 동일한 방법을 사용하여 250msec epoch에서 VEP의 샘플링 속도를 10kHz로 설정합니다. ERG 및 VEP 기록 모두에 대해 10msec의 사전 자극 기준선을 허용합니다. 이렇게 하려면 "설정" 탭을 클릭하십시오. "Stimulator"를 선택하여 새 대화 창을 불러옵니다. 해당 창의 "모드"에 대한 드롭다운 목록에서 "펄스"를 선택합니다. 을 클릭하고 "delay" 값을 "10ms"로 설정합니다.
      3. ERG 대역 통과 필터링을 0.3 - 1,000Hz(- 3dB)로 설정합니다. 이 작업은 데이터 수집 소프트웨어에서 "Bio Amplifier"를 클릭하여 수행됩니다. 그런 다음 "High Pass"의 값을 "0.3Hz"로 설정하고 "Low Pass"의 값을 "1kHz"로 설정합니다.
      4. 2.1.1.3에서 위에서 언급한 방법을 사용하여 인간 VEP 기록에 대해 ISCEV(International Society for Clinical Electrophysiology of Vision)에서 권장하는 대로 VEP 대역 통과 설정을 0.1 - 100Hz(- 3dB)로 설정합니다.

2. 전극 준비

1. 전극 리드에 은선 또는 악어 클립을 각각 부착하여 ERG 활성/비활성 및 VEP 활성/비활성 전극을 맞춤 제작합니다. 상업적으로 확보된 접지 전극.
2. 4개의 맞춤형 전극의 경우 전극 리드 확장에서 수컷 끝을 자릅니다. 메스 날로 외부 폴리테트라플루오로에틸렌 절연 코팅을 1cm 제거하여 내부 와이어가 손상되지 않도록 합니다.
3. 70mm 길이의 은선(0.3mm 두께)을 절단하고 직경 8mm의 루프를 형성하여 쥐눈을 둘러싸는 ERG 비활성 전극을 사전 성형합니다. 1ml 피펫 팁에 고리를 형성하여 균일한 원을 준비합니다.
4. 70mm 길이의 은을 절단하고 세로 지름 ~ 8mm의 타원을 형성하여 쥐 앞니에 걸어 성형 전 VEP 비활성 전극.
5. 30mm 길이의 은선을 절단하고 쥐 각막(직경 ~ 1-2mm)에 부드럽게 접촉하도록 작은 고리를 형성하여 ERG 활성 전극을 사전 성형합니다.
6. 은을 노출된 내부 와이어와 얽혀 전극 리드에 전극(2 ERG 활성, 2 ERG 비활성, 1 VEP 비활성)을 단단히 부착합니다.
7. 과도하게 노출된 금속을 마스킹 테이프로 절연하여 광전지 인공물을 줄입니다.
8. ERG 비활성 전극에서 작은 후크 앤 루프 패스너(~ 5mm × 20mm)를 마스킹 테이프에 붙여서 설치류 넥 스트랩에 안정적으로 부착할 수 있습니다.
9. 악어 클립을 전극 리드의 내부 와이어에 부착하여 VEP 활성 전극을 만듭니다.
10. 녹음하기 전에 신호 전도를 개선하기 위해 9V DC 소스를 사용하여 20초 동안 염화물로 은선의 노출된 표면(즉, 비활성 링 및 활성 팁)을 전기도금합니다.
    1. 이렇게하려면 ERG 전극 와이어 (1 차 세포의 양극 역할)의 은색 팁을 일반 식염수에 담그고이 전극 와이어의 다른 쪽 끝을 9V 배터리의 양극 단자에 연결합니다.
    2. 다른 전선(음극)을 배터리의 음극 단자에 연결하고 다른 쪽 끝도 식염수에 담그십시오. 20초 후에 분리하고 ERG 전극선의 은색 팁이 흰색으로 고르게 코팅되는지 관찰합니다.
       참고: 염화물 코팅의 개통성을 보장하기 위해 각 실험 세션(~ 최대 8시간)에 대해 새로운 ERG 전극을 준비합니다.

3. 동물 준비

1. 조명이 밀폐된 방에서 녹음하기 전에 하룻밤(≥ 8시간) 동물을 어둡게 적응시킵니다. 실내 조명을 끄고 모든 문과 블라인드를 닫아 최대한 어두운 환경에 적응하도록 합니다. 문/창문 접합부 주변에 차광 재료를 배치하고 두꺼운 검은색 커튼 밖에 컴퓨터 스크린을 배치하여 빛 누출을 최소화합니다.
2. 막대 감도를 유지하기 위해 어두운 빨간색 발광 다이오드(LED; 17.4 cd.m-2, λ_max = 600 nm)를 사용하여 어두운 방에서 동물 준비를 수행합니다.
3. 케타민/자일라진(60: 5mg/kg)을 근육주사하여 쥐를 마취합니다. 발 꼬집음 반사가 없는 경우 충분한 마취 깊이를 확인하십시오.
4. 진정을 유지하려면 필요한 경우 50분 후에 추가 용량의 마취(초기 용량의 50%)를 투여합니다.
5. 추가적인 국소 마취를 위해 각 눈에 0.5% 프록시메타카인 한 방울을 바르고 과도한 액체를 깜박입니다.
6. 동공 확장을 위해 각 눈에 0.5% 트로피카마이드 한 방울을 바르고 과도한 체액을 말리십시오.

4. ERG 및 VEP 전극 위치

확인

1. 패러데이 케이지에 위치한 Ganzfeld 그릇 앞의 ERG 플랫폼에 동물을 놓습니다. 전기 생리학적 기록에 전기 노이즈가 발생할 수 있으므로 전기 가열 패드를 사용하지 마십시오.
   알림: 플랫폼은 체온을 유지하기 위해 순환 가열수 플랫폼에 부착됩니다.
2. 목덜미 주위에 단단히 고정하되 단단히 고정하지 않은 벨크로 패스너 스트립을 사용하여 동물을 플랫폼에 고정합니다.
3. 마취된 쥐의 아래쪽 앞니 주위에 비활성 VEP 전극을 겁니다.
4. 눈의 적도 주위로 공막 고리를 비침습적으로 둘러싸서 ERG 비활성 전극을 배치합니다. 목덜미 주위의 벨크로 패스너 스트립에 전극을 부착하여 이를 안정화합니다. 반대쪽 눈에 대해 반복합니다.
5. 두개골에 미리 이식된 스테인리스 스틸 나사에 악어 클립을 부착하여 VEP 활성 전극을 고정합니다.
6. 신호 품질을 개선하기 위해 ERG 활성 전극을 배치하기 전에 1% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 각막에 소량 떨어뜨립니다.
   참고: 비스코스 유체는 또한 설치류에서 건조형 백내장의 형성을 최소화하기 위해 실험 전반에 걸쳐 각막 수분을 유지하는 데 도움이 됩니다.
7. 아래 앞니에 1% 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨을 소량 떨어뜨려 VEP 비활성 전극의 접촉을 개선하여 신호 품질을 개선합니다.
8. 맞춤형 입체 암에 부착된 미세 조작기를 사용하여 ERG 활성 전극을 중앙 각막 표면에 가볍게 닿도록 배치합니다.
9. 2 - 5 mm의 지상 바늘 전극 (스테인레스 스틸)을 꼬리에 피하로 삽입하십시오.
10. 필요한 경우 신호 품질을 개선하기 위해 기록하기 전에 아래쪽 눈꺼풀에서 과도한 액체를 건조시킵니다.
11. 플랫폼을 Ganzfeld 그릇에 더 가깝게 밀어 동물의 눈이 그릇의 입구와 정렬되도록 하여 양쪽 망막의 균일한 조명을 가능하게 합니다(2.4.1단계 참조).
12. 패러데이 케이지를 닫아 외부 소음을 줄입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
앨리게이터 클립	일반 브랜드	HM3022	VEP 나사 전극을 케이블에 연결하기 위한 스테인리스 스틸 26mm 클립
생체 증폭기	광고	ML 135 (ML	ERG 및 VEP 신호 증폭용
카르복시메틸셀룰로오스나트륨 1.0%	엘러간	CAS 0009000-11-7	활성 ERG 전극의 신호 품질을 개선하기 위한 점성 유체
카프로펜 0.5%	화이자 동물 건강 그룹	CAS 53716-49-7	독점 명칭 : Rimadyl injectable (50 mg / mL). 수술 후 진통제의 경우 생리식염수를 0.5%(5mg/mL)로 희석합니다.
클로르헥사딘 0.5%	오리온 연구소	27411, 80085	수술 기구 소독용
순환 수조	라우다-쾨니히스호펜	MGW 라우다	수술 중 마취된 동물의 체온 유지 및 전기생리학적 기록
치과 아말감	데구덴트 GmbH	64020024	전극-두개골 어셈블리를 감싸서 더 견고하게 만들기 위해
치과 버	Storz Instruments, 바우쉬 & 롬	#E0824A	VEP 나사를 이식하기 위해 각 반구의 두개골에 작은 구멍을 만들기 위한 ~0.7mm 직경의 소형 드릴 헤드
훈련	보쉬	Dremel 300 시리즈	트레패닝을 위한 자동 드릴
전극 리드	잔디 텔레팩터	F-E2-30	은선 전극을 증폭기에 연결하기 위한 백금 케이블
패러데이 케이지	맞춤 제작		어두운 적응을 유지하기 위해 내광성을 보장합니다. 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 Ganzfeld 설정을 둘러쌉
거즈 면봉	Multigate 의료 제품 Pty Ltd	57-100B	수술 중 절개 부위와 노출된 두개골 표면을 건조시키기 위해
Ganzfeld 적분구	Photometric Solutions International (포토메트릭 솔루션)		맞춤형으로 설계된 광 자극기: 직경 36mm, 조리개 크기 13cm
VELCRO	벨크로 호주 Pty Ltd	벨크로 브랜드 재사용 가능한 랩	전극과 동물을 기록 플랫폼에 고정하기 위한 후크 앤 루프 패스너
이소플루란 99.9%	애보트 오스트랄라시아 Pty Ltd	CAS 26675-46-7	독점 이름 : Isoflo (TM) 흡입 마취제. VEP 전극 임플란트 수술을 위한 산소 가스와 혼합된 제약 등급 흡입 마취제
케타민	트로이 연구소	일리움 케타밀	독점 이름 : Ketamil Injection, 브랜드 : Ilium. 전기생리학적 기록을 위한 제약 등급 마취제
럭시온 LED	필립스 조명 Co.		광 자극용: 5와트 LED 2개와 1와트 LED 1개.
마이크로 매니퓰레이터	하버드 기구	학사4 50-2625	녹음 중 ERG 활성 전극을 유지합니다.
바늘 전극	잔디 텔레팩터	F-E2-30	ERG와 VEP 모두의 접지 전극 역할을 하기 위해 꼬리에 피하 삽입
페닐에프린 2.5% 최소량	바우쉬와 롬	CAS 61-76-7	ERG 기록을 위한 최대 팽창을 달성하기 위해 트로피카마이드를 주입합니다.
포비돈 요오드 10%	사노피-아벤티스	CAS 25655-41-8	소유명 : Betadine, 면도 한 피부를 수술 할 수있는 방부제 10 %, 500 mL
Powerlab 데이터 수집 시스템	광고	ML 785 (영문	LED를 제어합니다.
프록시메타카인 0.5%	알콘 연구소	CAS 5875-06-9	ERG 기록 중 각막 마취용
식염수	젤플렉스		Non-injectable, 은 와이어 전극 전기 도금용
스코프 소프트웨어	광고	버전 3.7.6	Powerlab 시스템을 통해 자극을 동시에 트리거하고 데이터를 수집합니다.
실버(가는 환선)	A&E 금속	0.3 밀리미터	활성 및 비활성 ERG 전극 및 비활성 VEP 전극을 만드는 데 사용됩니다
스테인리스 스트릴 나사	마이크로패스터너		0.7mm 샤프트 직경, 3mm 길이로 1차 시각 피질에 이식하고 활성 VEP 전극 역할을 합니다.
입체식 프레임	데이비드 코프	모델 900	Paxinos & Watson의 2007년 쥐 뇌 아틀라스 좌표에 따라 1차 시각 피질을 찾기 위한 작은 동물 입체 기구
수술용 칼날	스완 - 모튼 (주)	206	VEP 전극을 이식하기 위해 1차 시각 피질을 오버레이하는 피부 부위를 절개하기 위해
봉합 사	상하이 Pudong Jinhuan 의료 제품 Co., Ltd		3-0 실크 꼰 봉합사 비흡수성, VEP 전극 이식 수술 중 피부 수축용
토브라마이신 아이 연고 0.3%	알콘 연구소	CAS 32986-56-4	독점 이름: Tobrex. 수술 후 피부 상처 주위에 도포하는 예방적 항생제 연고
트로피카미드 0.5%	알콘 연구소	CAS 1508-75-4	독점 이름 : 0.5 % Mydriacyl 안약, ERG 기록을위한 mydriasis를 달성하기 위해 주입
자일라진	트로이 연구소	일리움 자일라질-100	전기생리학적 기록을 위한 제약 등급 마취제
피펫 팁	에펜도르프 Pty Ltd	0030 073.169	Eppendorf epTIPS 100 - 5000 mL, 맞춤형 전극용
Lethabarb 안락사 주사	Virbac (호주) Pty Ltd	LETHA450	신속한 안락사를 위한 325mg/mL 펜토바르비탈 나트륨
마이크로소프트 오피스 엑셀	마이크로소프트	버전 2010	데이터 분석을 위한 스프레드시트 소프트웨어