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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 퍼핑 피펫 장치 설정
참고: 이 설정에는 유리 피펫, 튜브, 주사기, 마이크로 매니퓰레이터 및 버퍼(Hank's)의 5가지 기본 구성 요소가 있습니다.표 1. 생리학적으로 관련된 염 농도가 있는 모든 완충액을 이 설정에 사용할 수 있습니다.
- 마이크로피펫 풀러와 표 2.
의 사양을 사용하여 붕규산 피펫을 약 45μm 직경의 개방 팁으로 당깁니다.
참고: 45μm가 실험 조건에서 피펫 개구부의 직경에 적합한 크기인 것으로 밝혀졌습니다. 개구부 크기의 약간의 변화는 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다. 이 숫자에서 더 큰 이탈은 튜브를 통해 파이펫에 연결된 주사기의 높이를 조정하여 정맥류 유도에 여전히 작동해야 하지만 이를 위해서는 압력 값을 다시 보정해야 한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다.
- 피펫의 당기지 않은 끝을 얇은 고무 튜브에 삽입합니다.
메모: 튜빙 벽은 유체 저항을 최소화하기 위해 얇고 단단해야 하며, 주사기의 높이가 저항을 무시할 수 있는 수준으로 피펫을 통해 흐르는 유체의 압력에 정비례하도록 해야 합니다. 튜브의 길이는 저항을 더욱 최소화하기 위해 약 0.6m를 넘지 않아야 합니다.
- 회전 가능한 밸브가 있는 커넥터를 통해 튜브의 다른 쪽 끝을 10mL 플라스틱 주사기에 연결합니다.
메모: 플라스틱 주사기는 피펫에서 흐르는 가정된 압력의 정확한 측정을 보장하기 위해 일정하고 측정 가능한 높이로 유지되어야 합니다. 190mm의 높이가 사용되었는데, 이는 최소한의 압력을 제공하지만 축삭돌기의 정맥류를 안정적으로 유도하기 때문입니다. 압력으로 인해 셀이 커버슬립 표면에서 분리되는 경우 다른 높이 값도 사용할 수 있습니다. 실험 전반에 걸쳐 동일한 설정을 사용하는 것이 좋습니다.
- 피펫을 micromanipulator의 나사 상단에 삽입하여 피펫을 제자리에 고정합니다. 마이크로 매니퓰레이터 암에 부착된 상단이 평평한 금속 나사를 조여 고무 튜브가 부착된 곳 바로 위에 있는 피펫의 당기지 않은 끝을 잡습니다. 피펫을 뉴런 함유 커버슬립 표면과 45° 각도로 각도를 맞춥니다. 알림: 미세 조작기는 고무 튜브를 조이지 않고 피펫을 잡을 수 있도록 구성해야 합니다. micromanipulator는 세포 범위 내에 정확하게 배치하기 위해 x, y 및 z 방향으로 피펫의 움직임을 허용해야 합니다. 장치의 그래픽과 사진이 아래에 제공됩니다(그림 1).
- 형광 필터를 켜고 조리개를 열고 대물렌즈를 통해 들어오는 형광 반점을 볼 수 있는지 확인합니다. micromanipulator를 사용하여 피펫을 팁과 형광 반점과 일치하는 위치로 이동하고 피펫을 세포 배양 접시 높이(35mm x 10mm) 바로 위의 위치로 내립니다. 제자리에 고정되면 투과광을 켜고 형광을 끕니다.
- 핀셋을 사용하여 세포 배양 플레이트에서 커버슬립 1개(세포가 피펫 쪽을 향함)를 실온에서 약 2mL의 Hank's buffer가 들어 있는 세포 배양 접시에 추가합니다.
- 커버슬립이 들어 있는 배양 접시를 내시경에 놓습니다.
- 미세 초점 손잡이와 20X 대물렌즈를 사용하여 세포에서 약 4바퀴(약 0.4mm) 위에 있는 평면에 초점을 맞춥니다. micromanipulator를 사용하여 피펫 팁이 초점이 맞춰지고 접안렌즈를 통해 보이는 비행기의 왼쪽 중앙에 위치하도록 배치합니다.
메모: 수상돌기는 그것이 유래한 세포체와 동일한 프레임에 있어야 하는 돌기입니다. 축삭 정맥류를 유도하려면 세포체에서 내측 및 원위 축삭돌기까지 더 긴 돌출부를 따라야 합니다.
2. Stretchable-membrane System을 이용한 피펫 압력 교정
- 미세 제작된 실리콘 멤브레인(직경 500μm, 두께 50μm)이 포함된 시스템 위에 위에서 설명한 것과 정확히 동일한 매개변수로 퍼핑 피펫 장치를 설정하고 현미경을 멤브레인 표면에 초점을 맞춥니다.
메모: 이 시스템은 작은 압력 값을 측정하도록 설계되었으며 시스템에 대한 설명은 이전에 게시되었습니다. 이 측정은 정확히 동일한 퍼핑 설정이 사용되는 경우 퍼핑 실험에 대해 한 번만 수행하면 됩니다.
- 현미경을 마이크로닷 배열(중심 사이에서 측정한 직경 4μm, 거리 10μm)에 초점을 맞춥니다. 스톱 밸브를 돌리고 유체가 피펫에서 흘러나오도록 합니다. 컨포칼 현미경으로 유체 압력에 반응하는 멤브레인의 편향을 검사합니다.
- 선형 모형을 사용하여 멤브레인의 처짐과 관련된 해당 압력을 결정합니다.
메모: 최근 연구에 따르면 190mm 주사기 높이에 대해 w= -3.143 ± 0.69 μm의 편향이 얻어졌지만, 이는 주사기 높이가 유일한 결정 요인은 아니지만 생리학적 및 병리학적 범위 내에 있는 현재 피펫 설정에서 0.25 ± 0.06 nN/μm2의 압력을 생성했습니다. 다른 요인들도 뉴런의 정확한 압력 값에 영향을 미치는데, 여기에는 피펫 개구부, 세포에 대한 피펫 팁의 위치(거리 및 각도), 심지어 튜브의 유연성이 포함됩니다.
3. 정맥류를 유발하기 위한 퍼핑
- 피펫이 제자리에 놓이면 관심 영역이 포함된 평면에 현미경의 초점을 맞춥니다. 세포와 프로세스는 퍼핑 영역 내의 이미징 필드(카메라의 라이브 캡처로 보임)의 왼쪽 절반에 배치하고 오른쪽 절반은 퍼핑 영역 외부에 배치합니다.
메모: 뉴런의 축삭돌기와 수상돌기의 광범위한 성장으로 인해 뉴런의 모든 과정이 동일한 팽창 영역 내에 있을 가능성은 거의 없습니다. 이것은 실제로 이 시스템의 장점 중 하나이며, 이를 통해 퍼핑의 국소 효과를 조사할 수 있습니다. 정맥류를 유발하는 데 사용할 수 있는 퍼핑에는 장기 퍼핑과 맥박 퍼핑의 두 가지 유형이 있습니다.
- 피
- 장시간 퍼핑
- 배양된 뉴런이 들어 있는 커버슬립 위 190mm 높이에 주사기를 놓습니다. 최적화된 노출 시간으로 관심 영역의 타임 랩스 이미징을 시작하여 명확한 신경 세포 형태를 드러냅니다. 2초 간격(총 30초)으로 최소 15프레임을 기준선으로 캡처합니다. 간격은 실험에 따라 조정할 수 있습니다. 프레임 16에서 주사기의 회전 가능한 스톱 밸브를 열고 유체가 75프레임(150초) 동안 흐르도록 합니다. 프레임 75에서 밸브를 꺼서 유체 흐름이 멈추도록 합니다. 비디오 캡처를 중지합니다.
참고: 이것은 5-10초 이내에 뉴런 7-9 DIV에서 축삭 정맥류를 유도해야 하는 반면, 오래된 뉴런은 정맥류를 형성하는 데 더 오래 걸립니다.
- 펄스(2초 지속) 퍼핑
- 주사기를 적절한 높이(190mm)에 놓습니다. 타임랩스 이미징을 시작하고 15초 간격으로 최소 30프레임(2초)을 캡처합니다. 프레임 16에서 주사기의 밸브를 열고 유체가 흐르도록 한 다음 2초 후에 밸브를 닫습니다. 밸브를 다시 열기 전에 5-20초(테스트할 빈도에 따라 다름)를 기다리십시오. 밸브의 개폐를 반복하여 유체 펄스를 생성하고 총 150-300초 동안 계속합니다. 회복 단계를 캡처하기 위해 20분 동안 타임랩스 이미징을 계속합니다.
메모: 간격이 10초보다 길면 펄스가 현저히 적은 정맥류를 유발합니다. 20초 간격에서는 펄스에 의해 정맥류가 유도될 수 없습니다. 신뢰할 수 있고 일관된 정맥류 형성을 얻으려면 주사기 높이가 약 190mm가 되어야 합니다. 주사기 높이와 유체 압력은 세포가 커버슬립 표면에서 분리되기 시작하는 지점까지 상승해서는 안 됩니다.
- 사용하기 하루 전에 약 10mL 70% 에탄올을 셋업을 통해 흘려 셋업(피펫, 튜브 및 주사기)을 청소하십시오. 에탄올 세척 후 설정을 통해 10mL의 Hank's buffer(또는 원하는 완충액)를 흘려보내 그날 사용할 수 있도록 시스템을 준비합니다. 그날의 실험을 마친 후 앞서 설명한 대로 에탄올로 설정을 청소하여 밤새 오염 물질이 번식하는 것을 방지합니다.
표 1: 행크의 버퍼 레시피. 이 레시피는 퍼핑 프로토콜과 라이브 셀 이미징 중에 사용되는 버퍼를 준비합니다.
| Hank's buffer(필터, pH = 7.4, 4°C에서 보관 |
| 150 밀리미터미터 | 염화나트륨 |
| 4 밀리미터의 | 케이클 |
| 1.2 밀리미터미터 | 마그네슘Cl2 |
| 1 밀리엠 | 염화나트륨2 |
| 10 mg/mL | D-포도당 |
| 20 밀리미터미터 | 헤페스 |
표 2: 파이펫 풀링 매개변수. 직경이 약 45μm인 개구부를 얻기 위해 피펫 풀러에 설정할 매개변수를 제공합니다.
호
분
개
명
명
| 피펫 당기는 매개변수 |
| 열 | 끌다 | 속도 | 지연 | 압력 | 램프 |
| 501 | 0 | 15 | 1 | 500 | 530 |
