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1. Live Mouse Brain에 Mesh Electronics의 입체 주입
참고: 마우스는 75mg/kg 케타민과 1mg/kg 덱스도미터의 혼합물로 복강 내 주사로 마취되었습니다. 마취 정도는 수술을 시작하기 전에 발가락 꼬집기 방법으로 확인되었습니다. 마취 상태에서 37°C의 항상열 담요 위에 마우스를 올려 체온을 유지했습니다. 수술을 위해 모든 금속 수술 기구를 사용 전 1시간 동안 고압멸균, 멸균 장갑 사용, 수술 내내 핫 비드 살균기 사용, 수술 부위 주변의 멸균 구역 유지, 70% 에탄올로 플라스틱 기구 소독, 절개 전에 제모된 두피 피부에 요오드포를 준비하는 것을 포함하되 이에 국한되지 않는 적절한 멸균 기술이 시행되었습니다. 생존 수술의 경우 수술 종료 후 상처 부위에 항생제 연고를 바르고 마우스를 37°C 발열 패드가 장착된 케이지로 되돌려 보냈습니다. 쥐는 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 방치되지 않았다. 생쥐는 수술 후 최대 72시간 동안 12시간마다 체중 0.05mg/kg의 용량으로 복강내 주사를 통해 부프레노르핀 진통제를 투여했습니다. 쥐는 수술 후 다른 동물과 분리되었습니다. 마우스는 체중 270mg/kg의 용량으로 펜토바르비탈의 복강내 주사 또는 경심 관류를 통해 안락사되었습니다.
- 마우스를 마취하고 입체 프레임에 고정합니다.
- 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 안구 윤활제를 바르십시오.
- 치과 드릴과 정위 프레임을 사용하여 두개골의 원하는 좌표에서 개두술을 엽니다. 스테인리스강 접지 나사 또는 와이어를 삽입하기 위해 주입 부위에서 멀리 떨어진 곳에서 두 번째 개두술을 엽니다.
- 치과 용 시멘트로 두개골에 클램핑 기판을 고정하십시오. 절차의 뒷부분에서 접는 단계의 신뢰성을 향상시키기 위해 기판에서 약 1mm 너비의 간격을 자릅니다.
메모: "L"자 모양으로 절단된 연성 케이블(FFC)이 잘 작동하지만(그림 4A), 32채널 ZIF(Zero Insertion Force) 커넥터(0.18mm ± 0.05mm 두께의 케이블용으로 설계됨)에 적합한 두께만 있으면 많은 재료가 작동합니다.
- 메쉬 전자 장치가 포함된 바늘이 있는 피펫 홀더를 직각 엔드 클램프를 사용하여 입체 프레임에 장착합니다(그림 2C 및 그림 3A).
- 약 0.5–1m 길이의 모세관 튜브를 사용하여 피펫 홀더의 측면 배출구를 주사기 펌프(그림 3D)에 고정된 5mL 주사기에 부착합니다.
메모: 파이펫 홀더에 연결하기 전에 모세관 튜브에 기포가 없는지 확인하십시오. 기포는 주입 중 흐름을 방해하고 메쉬 전자 장치의 부드럽고 제어된 전달을 방해할 수 있습니다.
- 입체 프레임을 사용하여 바늘 끝을 뇌 내의 원하는 시작 위치에 배치합니다.
메모: 여기에 사용된 메시 전자 프로브는 약 2mm 길이에 걸쳐 퍼져 있는 기록 전극과 메시 전자 장치의 시작 가장자리(그림 1A의 가장 왼쪽 가장자리)에서 약 0.5mm 떨어진 곳에 첫 번째 전극으로 설계되었습니다. 이러한 이유로 입체성 좌표는 시작 위치가 관심 뇌 영역보다 0.5mm 더 깊도록 선택해야 합니다. 메시 전자 장치 내 기록 전극의 분포와 위치는 마스크 설계 과정에서 자유롭게 선택할 수 있으며, 기록 전극이 입체선 궤적을 따라 주입될 때 관심 있는 뇌 영역에 걸쳐 있도록 선택해야 합니다.
- 카메라(그림 3B)를 배치하여 유리 바늘 안에 있는 메시 전자 프로브의 상단을 표시합니다. 일부 소프트웨어를 사용하면 사용자가 화면에 선을 그려 메쉬 전자 장치의 원래 위치를 표시할 수 있습니다.
- 주사기 펌프를 저속으로 설정하고 Start를 눌러 흐름을 시작합니다. 10mL/h는 400μm 내경 모세관 바늘의 일반적인 시작 유속입니다. 메쉬 전자 프로브가 바늘 내에서 움직이지 않으면 유속을 천천히 높이십시오.
메모: 주사 부위를 둘러싼 조직을 손상시킬 수 있으므로 뇌에 주입되는 액체의 양을 최소화하는 것이 중요합니다. 주입된 메쉬 길이 1mm당 25μL 미만의 주입 부피에서 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 이상적인 값은 이 볼륨의 절반 미만입니다. 우리 실험실에서는 일반적으로 4mm 주입된 메쉬 길이당 10-50μL를 주입합니다.
- 메쉬 전자 프로브가 바늘 내에서 움직이기 시작하면 입체 요법 프레임을 사용하여 메쉬 전자 프로브가 주입되는 것과 동일한 속도로 바늘을 후퇴시키고 메쉬 전자 장치의 표시된 원래 위치를 가이드로 사용합니다.
메모: 시야각(FOV) 주입 방법이라고 하는 이 절차를 통해 구겨지거나 탈구되지 않고 표적 뇌 영역에 메쉬 전자 장치를 정밀하게 전달할 수 있습니다. 메쉬 전자 프로브가 바늘 내에서 움직이기 시작하면 유속이 감소할 수 있는 경우가 많습니다. 저희 실험실에서는 메쉬와 모세관 바늘 벽 사이의 정적 마찰을 극복하기 위해 20–30mL/h의 유속이 필요한 경우가 많지만 주입 공정이 시작되면 속도를 10mL/h로 줄일 수 있습니다. 유속과 주입량은 일반적으로 직경이 작은 모세관 바늘의 경우 더 작습니다.
- 계속 식염수를 흐르게 하고 바늘이 두개골을 빠져나갈 때까지 바늘을 집어넣는다. 주사기 펌프에서 흐름을 중지합니다.
2. 입력/출력 인터페이스
참고: 이 시점에서 메시 전자 프로브는 선택한 궤적을 따라 뇌 내의 원하는 시작점에서 주입되었습니다. 바늘은 후퇴되어 개두술 바로 위에 있으며, 뇌에서 바늘에 이르는 메쉬 전자 상호 연결과 바늘 내부에 여전히 입력/출력(I/O) 패드가 있습니다(그림 4B). 이 섹션에서는 인쇄 회로 기판(PCB; 그림 4, 그림 5)을 사용하여 메시 전자 프로브에 인터페이스합니다. PCB는 신경 기록 실험의 헤드 스테이지가 되는 절연 기판을 통해 ZIF 커넥터를 32채널 표준 증폭기 커넥터에 연결합니다. PCB는 다양한 헤드 스테이지 구성을 수용할 수 있도록 사용자 정의할 수 있습니다. 당사의 설계 파일은 요청 또는 리소스 웹 사이트, meshelectronics.org 에서 사용할 수 있으며 PCB 제조 및 조립 서비스 공급 업체로부터 PCB를 저렴하게 구입하는 데 사용할 수 있습니다.
- 입체식 프레임을 사용하여 바늘을 FFC 클램핑 기판과 갭을 가로질러 조심스럽게 안내하고 주사기 펌프로 용액을 흐르게 하여 메쉬 전자 상호 연결에서 느슨함을 생성합니다(그림 4C).
- 바늘이 클램핑 기판 위와 갭을 가로질러 있으면 빠른 속도로 흐름을 재개하여 메쉬 전자 I/O 패드를 클램핑 기판으로 배출합니다(그림 4D).
- 핀셋과 탈이온수(DI) 피펫을 사용하여 I/O 패드를 첫 번째 I/O 패드에 최대한 가깝게 약 90° 각도로 구부립니다.
메모: 굽힘은 후속 단계에서 PCB의 ZIF 커넥터에 패드를 삽입할 수 있도록 하는 데 필요합니다. ZIF 커넥터는 메시 전자 프로브의 32개 I/O 패드와 정확히 동일한 너비이므로 불완전한 90° 굽힘 또는 첫 번째 I/O 패드 직전에 굽힘이 발생하지 않으면 I/O 패드(그림 4E의 가장 왼쪽 패드)를 절단해야 합니다.
- I/O 패드를 정렬하고 펼친 후 메쉬 스템과 90° 각도가 되면 부드럽게 흐르는 압축 공기로 제자리에 건조시킵니다.
메모: 채널이 32개 미만인 메시 전자 프로브는 동일한 32채널 인터페이스 보드와 인터페이스할 수 있습니다. 예를 들어, 우리 연구실에서는 일반적으로 32채널 PCB가 있는 16채널 메시 전자 프로브를 사용합니다. 이를 통해 ZIF 커넥터 내에 추가 공간이 제공되어 인터페이스가 더 쉬워지며, 추가 비접촉 채널은 녹음 세션 중 임피던스 테스트를 통해 개방 회로로 쉽게 식별됩니다.
- I/O 패드 가장자리에서 약 0.5–1mm 떨어진 직선 가장자리에서 클램핑 기판을 자릅니다. 또한 PCB 실장 32채널 ZIF 커넥터에 삽입하는 데 방해가 되는 클램핑 기판의 외부 부품을 차단합니다(그림 4F).
- I/O 패드를 PCB의 ZIF 커넥터에 삽입하고 래치를 닫습니다(그림 4G). 측정 전자 장치를 사용하여 채널과 접지 나사 사이의 임피던스를 측정하여 성공적인 인터페이스를 확인합니다. 임피던스 값이 너무 높으면 ZIF 커넥터의 래치를 풀고 삽입을 조정한 다음 성공적인 연결이 확인될 때까지 다시 테스트하십시오.
- ZIF 커넥터와 노출된 메쉬 전자 장치 인터커넥트를 치과용 시멘트로 덮어 보호합니다. 기판의 틈새에서 PCB를 뒤집고 마우스 두개골에 시멘트로 PCB를 고정합니다(그림 4H).
메모: 갭에서 FFC를 구부리면 때때로 메시 전자 상호 연결을 끊을 수 있는 기계적 변형이 줄어듭니다.
- 시멘트가 굳어지도록 하여 PCB를 후속 녹음 세션 동안 인터페이스할 수 있는 견고하고 컴팩트한 헤드 스테이지로 바꿉니다(그림 4I).
3. 신경 기록 실험
- 마우스를 꼬리 가장자리 또는 다른 고정 장치에 놓습니다. 사전 삽입amp표준 liifier PCB를 헤드에 liifier 커넥터tage PCB. 별도의 케이블을 사용하여 참조 나사를 접지하십시오.
- 제한된 녹음의 경우 마우스를 고정 장치에 두십시오. 원하는 기간 동안 데이터 수집 시스템을 사용하여 데이터를 기록합니다(그림 5A).
- 자유롭게 이동하는 녹음을 위해 프리앰프 PCB를 삽입하고 기준 나사를 접지한 후 리퀴터에서 마우스를 해제하십시오. 마우스가 자유롭게 작동하는 동안 데이터 수집 시스템을 사용하여 원하는 시간 동안 기록합니다(그림 5B).
