동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 솔루션
- 슬라이싱 솔루션
- 슬라이싱 용액의 조성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 20x 원액을 미리 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 1x 슬라이싱 용액의 경우 NaHCO3 , 포도당 및 자당을 ddH2O에 용해시키고 20x 스톡을 첨가합니다. 삼투압이 315mOsm에서 320mOsm 사이인지 확인하고 4°C에서 1주일 이상 보관하지 마십시오.
- 두 개의 비커에 100mL의 슬라이싱 용액을 채우고 파라필름으로 덮습니다. 용액이 부분적으로 얼 때까지 냉동실에서 냉각합니다(-20°C 냉동고에서 약 80분). 가스 분산 튜브를 사용하여 얼음 위에서 95% O2/5% CO2로 슬라이스 용액의 두 비커를 20분 동안 거품을 냅니다.
- aCSF(Artificial Cerebrospinal fluid), 슬라이스 회복 및 유지용
- aCSF의 구성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 20x 원액을 미리 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 1x aCSF의 경우 NaHCO3와 포도당을 ddH2O에 용해시키고 20x 스톡을 추가합니다. 삼투압이 298-300mOsm 사이인지 확인합니다. 1일 이내에 용액을 사용하십시오.
- aCSF(녹음용 낮은 Ca2+)
- 낮은 Ca2+ aCSF의 조성은 표 1을 참조하십시오.
- 20x 원액을 미리 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 1x low Ca2+ aCSF의 경우 NaHCO3 및 포도당을 ddH2O에 용해시키고 20x(CaCl2 및 MgCl2 없음) 원액, CaCl2 및 MgCl2를 지정된 농도로 추가합니다. 삼투압이 298-300 사이인지 확인하십시오. 1일 이내에 용액을 사용하십시오.
- aCSF(녹음용 Sr2+)
- Sr2+ aCSF의 구성은 표 1을 참조하십시오.
- 20x 원액을 미리 준비하고 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오.
- 1x Sr2+ aCSF의 경우, NaHCO3 및 포도당을 ddH2O에 용해시키고 20x(CaCl2 및 MgCl2 없음) 원액, SrCl2 및 MgCl2를 지정된 농도로 첨가합니다. 삼투압이 298-300 사이인지 확인하십시오. 1일 이내에 용액을 사용하십시오.
- 내부 솔루션
- K-글루코네이트 기반 내부 용액의 조성에 대해서는 표 1을 참조하십시오.
- 20mL의 내부 용액을 만들려면 50mL 튜브에 분자 생물학 등급의 물 15mL를 추가합니다. 그런 다음 얼음 위에서 다음 단계를 수행합니다.
- 분자 생물학 등급의 물에서 1M 스톡 농도로 다음 용액을 미리 준비하십시오. 추가 (mL) : 2.32 K- 글루 콘산염, 0.24 Na- 글루 콘산염, 0.20 HEPES (4- (2- 하이드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산), 0.16 KCl, 0.05 K2-EGTA (칼륨 에틸렌 글리콜 -비스 (β- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'- 테트라 아세트산), 0.04 MgCl2를 50 mL 튜브에 넣으십시오.
- 100μL의 0.3M Na3GTP(구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염)를 추가합니다.
- 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 K2 ATP(아데노신 5'-트리포스페이트 디칼륨 염) 44.08mg의 무게를 측정하고 분자생물학 등급의 물 1mL를 추가한 다음 50mL 튜브에 추가합니다.
- 1M KOH로 pH를 7.2-7.4로 조정합니다. 삼투압이 283-289mOsm 사이인지 확인합니다.
2. 슬라이스 준비
- 도구 준비
- 회수 챔버(4개의 웰과 그물이 있는 250mL 비커로 구성)에 200mL의 aCSF를 추가하고 회수 챔버를 수조(35°C)에 놓습니다.
- 챔버를 파라핀 필름으로 덮고 유리 분산 튜브를 사용하여 95% O2/5% CO2로 aCSF에 최소 20분 동안 지속적으로 거품을 냅니다.
- 해부 도구(메스, 각진 가위, 집게, 고운 붓, 플라스틱 숟가락)를 설정합니다.
- 60mL 주사기에 1.1.4단계의 얼음처럼 차가운 슬라이싱 용액 약 15mL를 채웁니다.
- 웰 플레이트의 뚜껑에 여과지를 올려 해부 플랫폼을 준비합니다.
- 슬라이싱 챔버를 얼음 트레이에 넣고 트레이에 얼음을 채워 준비합니다.
- 블레이드 홀더에 일회용 블레이드를 고정하여 비브라톰을 설정합니다.
- 전사 피펫을 만들려면 파스퇴르 피펫의 끝을 부러뜨리고 부러진 끝 부분에 고무 전구를 놓습니다.
- 쥐의 뇌를 해부한다
- 척추 반사가 사라질 때까지 4% 이소플루란으로 포화된 방에서 동물을 마취합니다.
- 단두대를 사용하여 동물의 목을 베고 빠르게 뇌를 제거하십시오.
- 22번 메스 날로 꼬리에서 꼬리까지 정중선을 절개합니다.
- 옆으로 머리 양쪽의 두피를 벗겨냅니다.
- 가는 가위를 사용하여 뇌가 손상되지 않도록 주의하면서 꼬리에서 꼬리(전두골 측면 포함)까지 한쪽 두개골을 자릅니다.
- 겸자를 사용하여 뇌에서 두개골 조각을 들어 올리고 2.1.4단계의 주사기를 사용하여 15mL의 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액으로 뇌를 빠르게 냉각시킵니다.
- 두개골에서 뇌를 들어 올립니다.
- 95% O2/5% CO2로 거품을 일으킨 얼음처럼 차가운 슬라이스 용액(1.1.4단계)으로 채워진 비커 중 하나에 뇌를 넣습니다.
3. 마우스 시상하부 조각을 준비합니다.
- 원하는 뇌 영역과 절단 각도에 대해 뇌를 차단합니다(예: 관상 시상하부 절편의 경우 블레이드를 사용하여 시신경의 상부와 교두의 조직을 잘라내고 꼬리 블록이 뇌 기저부에 수직인 평평한 표면을 갖도록 합니다).
- 자른 여과지를 사용하여 앞쪽에서 뇌를 집어 올리고 순간 접착제를 사용하여 뒤쪽을 홀딩 플레이트에 붙입니다.
- 홀딩 플레이트를 슬라이싱 챔버에 빠르게 놓고 1.1.4단계에서 두 번째 비커의 슬라이싱 용액으로 채웁니다.
- 비브라토미에 슬라이싱 챔버와 얼음 트레이를 고정합니다.
- 슬라이싱 영역(뇌의 전방 및 후방)을 정의하고 250μm 두께의 관상 절편을 슬라이싱하기 시작합니다. 권장 매개변수: 속도 0.10mm/s, 진폭 2mm.
- 원하는 뇌 영역에 적합한 크기로 조각을 자릅니다.
- 35°C에서 30-45분 동안 슬라이스를 회수합니다. 그런 다음 보온 수조에서 회수 챔버를 제거하고 슬라이스가 실온에서 추가로 30분 동안 회복되도록 합니다. 남은 하루 동안 슬라이스를 실온에 보관하고 95% O2/5% CO2로 욕조에 지속적으로 거품을 내십시오.
3. 전체 셀 패치 클램프 레코딩
- 패치 피펫을 당깁니다.
- 파이펫 풀러 설명서에서 전체 셀 기록을 위해 제안된 파라미터를 사용하여 두꺼운 벽의 유리에서 패치 파이펫을 3-5MΩ의 파이펫 저항으로 당깁니다.
- 마이크로 주사기(상업용 또는 수제)를 사용하여 피펫 팁에 여과된 내부 용액을 채웁니다. 마이크로 주사기를 만들려면 1mL 주사기의 끝을 태우고 팁을 떨어뜨려 길고 가는 팁을 만듭니다.
- 전체 셀 구성을 가져옵니다.
- 기록 피펫을 슬라이스 바로 위에 놓고 전압 클램프 모드에서 피펫 전류를 오프셋합니다. 피펫에 약간의 양압을 가하고 스톱콕을 잠급니다.
- 멤브레인이 손상되지 않은 건강한 세포를 선택하고 피펫으로 접근합니다. 양압은 조직에 약간의 교란을 일으켜야 합니다(즉, 조직에 들어갈 때 조직의 느린 파동).
- 피펫이 세포 표면에 작은 딤플을 형성할 때까지 대각선 동작을 사용하여 피펫을 세포에 더 가깝게 천천히 계속 가져옵니다.
- 양압 잠금 장치를 해제합니다. 세포가 밀봉을 형성하기 시작하고 저항이 1GΩ 이상으로 증가합니다. 전압 클램프에서 셀을 -68mV로 유지합니다.
- 세포에서 대각선으로 약간 당겨 세포에서 과도한 압력을 제거합니다.
- 빠르고 느린 피펫 커패시턴스를 보상합니다.
- 피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 짧게 흡입하여 셀을 뚫고 전체 셀 구성을 얻습니다.
- 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어(예: Clampex)의 멤브레인 테스트 창에서 셀 모드로 전환합니다.
- 각 전압 클램프 기록 전에 동일한 소프트웨어를 사용하여 멤브레인 테스트를 수행하고 관련 매개변수(멤브레인 저항, 접근 저항 및 커패시턴스)를 실험실 책에 기록합니다.
- 후속 실험을 위해 기록조의 온도를 27–30°C로 유지하고 유속을 1.5–2.0mL/분으로 유지합니다.
표 1: 다양한 솔루션의 구성.
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| 용액 농도(mM) |
| 깔 끔 히 | 일반 aCSF | 낮은 Ca2+ aCSF | SR+ aCSF | 파이펫/내경 |
| 염화나트륨 | 87 | 126 | 126 | 126 | - |
| 케이클 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 8 |
| 염화칼슘2 | 0.5 | 2.5 | 0.5 | - | - |
| 재질 보기 SrCl2 | - | - | - | 2.5 | - |
| 재질 보기 MgCl2 | 7 | 1.5 | 2.5 | 1.5 | 2 |
| 나H2PO4 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | 1.25 | - |
| 나HCO3 | 25 | 26 | 26 | 26 | - |
| 포도당 | 25 | 10 | 10 | 10 | - |
| 자당 | 75 | - | - | - | - |
| K-글루코네이트 | - | - | - | - | 116 |
| Na-글루코네이트 | - | - | - | - | 12 |
| 헤페스 | - | - | - | - | 10 |
| 케이2-EGTA | - | - | - | - | 1 |
| 케이2ATP | - | - | - | - | 4 |
| 나3GTP | - | - | - | - | 0.3 |