동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. pHuC_Mermaid 플라스미드 생성
참고: 머메이드는 인산가수분해효소(Ci-VSP)를 포함하는 Ciona intestinalis(현재 Ciona robusta) 전압 센서의 전압 감지 영역(VSD)과 형광 공명 에너지 전달(FRET) 파트너 형광단 Umi-Kinoko Green(mUKG: 공여체) 및 주황색 방출 형광 단백질 Kusabira Orange(mKOk: 수용체)의 단량체 버전을 페어링하여 개발된 바이오센서입니다. 이 바이오센서의 경우, 막 탈분극에 의해 유도된 VSD 도메인의 구조적 변화는 공여체와 수용체 형광 단백질의 근접성을 증가시켜 이들 사이의 에너지 전달을 증가시킵니다(FRET 비율 증가). VSD는 원형질막에서 바이오센서의 효율적인 위치 파악을 보장합니다. 바이오센서(척수에서 신호는 중간뉴런과 운동 뉴런 모두에서 감지할 수 있음)의 뉴런 발현은 제브라피시 범신경 프로모터 HuC 아래에서 Mermaid open reading frame(ORF)을 복제하여 달성됩니다.
- T3 Universal 프라이머 및 Mermaid SmaI 프라이머(5'TATCCCGGGATTCGACGGTTCAGATTTTA)를 사용하여 Pfu(교정) DNA 중합효소와 함께 pCS4+ Mermaid 플라스미드의 Mermaid Open Reading Frame(ORF)을 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭하여 Mermaid ORF의 상류에 SmaI 제한 부위를 삽입합니다.
- 다음 PCR 혼합물을 사용하십시오: Pfu DNA 중합효소 0.5μL, 특정 10x 완충액 7.5μL, 10mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTP) 1μL, 디메틸 설폭사이드(DMSO) 2.5μL, 플라스미드 제제 0.5μL(50ng) 및 각 프라이머의 20μM 원액 1μL를 총 부피 50μL에 넣습니다.
- PCR 혼합물을 95°C에서 15초 동안 가열하고 50°C에서 15초 동안 프라이밍하고 72°C에서 총 35사이클에 걸쳐 4분 동안 연장합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 정제 키트를 사용하여 특정 무딘 PCR 산물을 겔 정제합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 단편을 pCMV-SC 블런트 벡터로 클로
닝합니다.
- Mermaid-positive plasmid(pCMV-SC_Mermaid로 명명됨)를 SmaI 제한 효소로 선형화하여 HuC promoter를 다음과 같이 삽입합니다.
- 제한 반응을 다음과 같이 설정합니다: 0.5 μL (10 U)의 SmaI 제한 효소, 2 μL의 kit 10x 완충액, 5 μg의 플라스미드 DNA를 총 20 μL의 부피에서 배양합니다.25 °C에서 1 시간 동안 반응을 배양합니다.
- 분해된 플라스미드를 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 정제 키트를 사용하여 겔 정제합니다.
- 한 쌍의 HuC 특이적 프라이머(HuCprom-forw1_SalI: 5′-GTAGTCGACCAGACTTGTCAAAAGGGTCCA 및 HuCprom-rev1: 5′-TCCATTCTTGACGTACAAAGATG)를 사용하고 ATG의 상류 3,150-bp 영역에 걸쳐 Pfu DNA 중합효소 및 제브라피시 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 HuC 프로모터(pHuC)를 PCR 증폭합니다.
- 다음 방식을 사용하여 PCR 혼합물을 설정합니다: 0.5 μL의 Pfu DNA 중합효소, 7.5 μL의 특정 10x 완충액, 1 μL의 10 mM dNTPs, 2.5 μL의 DMSO, 200 ng의 게놈 DNA, 1 μL의 20-μM 원액을 총 50 μL의 총 부피에서 각 프라이머의 20-μM 원액.
- 95 °C에서 2 분의 초기 단계 후, PCR 혼합물을 95 °C에서 15 초 동안 가열하고, 50 °C에서 15 초 동안 프라이밍하고, 총 35 사이클에 대해 72 °C에서 4 분 동안 연장합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 상용 겔 정제 키트를 사용하여 특정 무딘 PCR 산물을 겔 정제합니다.
- 총 부피 10 μL에서 1 μL의 T4 DNA 리가제와 1 μL의 특정 10X 완충액을 사용하여 정제된 pCMV-SC_Mermaid(단계 1.5) 및 pHuC DNA(단계 1.7)의 등몰 양을 접합합니다.4°C에서 16시간 동안 반응을 배양합니다.
- 제조업체의 지침에 따라 5 μL의 ligation 반응(step 1.8)으로 수용 세포의 부분 표본을 형질전환시킵니다.
- Sal I-EcoRV 이중 분해에 의해 promoter가 적절한 방향으로 삽입된 pHuC 양성 클론(pHuC_Mermaid)을 선택합니다(SalI 제한 부위는 1.6단계에서 promoter fragment의 업스트림에 삽입된 반면, EcoRV 제한 부위는 pCMV-SC plasmid의 polyadenylation 영역인 PolyA의 다운스트림에 위치함).
- 제한 반응을 다음과 같이 설정합니다: SalI 및 EcoRV 제한 효소 0.5 μL(10 U), kit10X 완충액 2 μL, pHuC_Mermaid DNA 1 μg을 총 20 μL. 37 °C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 아가로스 겔에 반응을 실행합니다.
2. 배아 미세주입
- 야생형(AB 균주) 또는 Sod1-G93R 성체 제브라피시에서 얻은 수정란을 플라스틱 피펫을 사용하여 10mm 페트리 접시에 옮깁니다.
- 배아를 차가운(4°C) 생선 물로 헹구고 즉시 마이크로인젝터를 사용하여 200pg의 pHuC_Mermaid 플라스미드와 함께 노른자에 미세주입합니다(미세주입 절차에 대한 전반적인 및 자세한 설명을 위해).
- 플라스틱 피펫을 사용하여 배아를 페트리 접시에 옮기고 다음 분석을 위해 원하는 발달 단계(수정 후 20-24시간, hpf)에 도달할 때까지 28°C의 어류수에서 배양합니다.
3. 자발적 꼬리 코일링 분석
참고: 릴루졸 약물 유무에 관계없이 20-24 hpf 배아에서 자발적인 꼬리 감기는 행동을 평가합니다.
- 0.2% DMSO(릴루졸 비히클)가 함유된 물고기 물로 채워진 90mm 원형 페트리 접시에 배아를 옮기고 끝이 날카로운 두 개의 보석상 집게를 사용하여 수동으로 디코리온화합니다. 배아를 5분 동안 배양합니다.
- 실체 현미경에 장착된 디지털 카메라를 사용하여 1분 동안 비디오를 녹화하는 동안 실온(RT)에서 꼬리 코일링을 감지합니다. 30 frames/s의 시간 해상도로 시계열을 획득합니다.
- 자발적인 꼬리 코일링의 빈도를 시간 단위당 굽힘 수(반대 및 동측 모두)를 계산하여 계산합니다.
- 릴루졸 약물의 효과를 평가하려면 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 배아를 5μM 릴루졸이 함유된 생선 물로 채워진 새로운 90mm 페트리 접시로 옮깁니다.
- 배아를 5분 동안 배양한 후 1분 분량의 비디오를 녹화하고 위와 같이 행동 분석을 수행합니다.
4. 살아있는 배아에서 머메이드 바이오센서 시각화를 위한 이미징 설정: 기증자 및 수용체 신호의 동시 감지
- 20 - 24 hpf 배아를 35mm 유리 바닥 이미징 접시 안에 37°C의 어류 물에 1% 저융점 아가로스에 장착합니다. 배아를 옆으로 향하게 합니다. 아가로스가 실온에서 응고될 때까지 기다립니다.
- 이미징 접시를 도립 현미경에 장착된 도립 공초점 스테이지로 이동합니다. 488nm 아르곤 레이저 라인으로 mUKG를 여기시키고 495 및 525nm 사이의 방출을 기록하여 20X 대물렌즈(0.7 numerical aperture, NA)로 바이오센서를 발현하는 운동 뉴런을 식별합니다.
- FRET 측정의 경우 488nm 레이저 라인으로 FRET 쌍의 공여체인 mUKG를 여기합니다. 양방향 모드에서 8,000Hz에서 작동하는 공진 스캐너를 사용하여 공여체에서 방출되는 형광(495 및 525nm 사이)과 mKOk 수용체에서 방출되는 형광(550 및 650nm 사이, FRET 채널)을 동시에 검출할 수 있습니다. 가능한 경우 473nm 레이저를 사용합니다.
메모: 공여체의 여기 효율은 약간 감소하지만(488nm에서 93% 대신 85%), 수용체의 교차 여기도 감소합니다(488nm의 경우 17%에서 473nm 레이저 라인의 경우 9%로).
- 광독성과 형광단 표백을 줄이려면 레이저 라인의 강도를 줄여 샘플의 조명을 최소화합니다(수집 소프트웨어의 빔 경로 창에서).
- 실험 시작 시 설정되고 세션 내내 일정하게 유지되는 게인 및 오프셋 파라미터와 일치하도록 여기를 최적화합니다. 오프셋을 설정하려면 이미지의 색상을 강도 값으로 변경하고(Q 조회 테이블 사용) 레이저를 끈 상태에서 스캔하는 동안 오프셋 노브(스마트 오프셋)를 돌려 배경 픽셀의 강도가 0보다 약간 높도록 합니다. 동일한 조회 표에서 스캔하는 동안 레이저를 켜서 게인 노브(스마트 게인)를 돌려 신호 대 잡음비를 최대화하고 포화된 픽셀을 피하도록 주의하십시오.
- 열린 핀홀(2개의 에어리 유닛)을 사용하여 16비트 이미지를 획득하여 정량 분석을 위한 충분한 동적 범위를 제공합니다. 획득 속도를 높이고 광표백을 최소화하기 위해 평균화를 피하십시오.
- 소프트웨어 획득 창의 드롭다운 메뉴에서 512 x 64 픽셀(픽셀 크기: 605 nm)의 이미지 필드 크기를 선택합니다.
- 획득 모드 창에서 드롭다운 메뉴에서 xyt(time lapse on a single xy plane)를 선택하고 단일 xy 평면을 획득하여 배아 척수 뉴런 전압의 변화를 기록하고, 1분 동안 30ms마다 하나의 이미지를 기록하도록 획득 매개변수를 설정합니다.
- 동일한 뉴런의 막 탈분극에 대한 릴루졸 투여의 효과를 평가하기 위해 5μM 릴루졸을 함유한 어류수를 첨가한 후 5분 후에 새로운 데이터 세트를 획득합니다.
- FRET 분석의 경우 ImageJ 매크로 Biosensor_FRET(단일 사슬 FRET 바이오센서 발현)을 사용합니다.
- t1에서 각 뉴런의 기저막 FRET 비율을 ((FRET 평균 - FRET 배경)/(공여자 평균 - 공여자 배경))으로 평가합니다. 여기서 FRET 및 공여체 평균 강도는 획득한 각 채널에 대해 세포 주위에 그려진 동일한 관심 영역(ROI)에서 계산된 평균 형광 강도이고 FRET 및 공여자 배경은 형광 샘플 없이 시야의 ROI에서 계산된 평균 형광 강도입니다.
메모: 플러그인 사용에 대한 자세한 단계별 설명은 www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/biosensor-fret 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
- 그래프 소프트웨어를 사용하여 서로 다른 실험 패러다임 간의 탈편광 빈도, 진폭 및 지속 시간을 비교합니다. 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교하고 P <0.05일 때 평균값을 통계적으로 다른 것으로 간주합니다.
