빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

초록

출처: Juusola, M., et al. 생체 내 광 자극에 대한 초파리 광수용체 및 중간뉴런의 세포 내 전압 반응을 기록하기 위한 전기생리학적 방법. J. Vis. 특급. (2016).

이 비디오는 움직이지 못하는 초파리의 눈에서 광수용체 활동의 전기생리학적 기록을 위한 프로토콜을 간략하게 설명하여 광 자극에 대한 반응으로 전압 변화를 정밀하게 측정할 수 있도록 합니다.

프로토콜

1. R1-R6 광수용체에서 기록

1. 미세 전극 작동 시 항상 접지하십시오 ampliifier(예:amp패러데이 케이지 또는 진동 방지 테이블의 금속 표면을 만짐으로써), 이렇게 하면 실수로 헤드 스테이지에 정전기를 전달하여 회로를 손상시킬 수 있습니다.
2. 두 개의 구즈넥 라이트 가이드(그림 1A)(패러데이 케이지 내부의 차가운 광원 포함)로 플라이 준비 플랫폼 폴을 위에서 비추어 플라이 홀더를 면밀한 시각적 제어 하에 원하는 위치의 폴에 배치할 수 있도록 합니다.
3. 플라이 홀더(플라이가 들어 있음)를 플라이 준비 플랫폼 폴에 장착합니다. 플라이의 왼쪽 눈이 조사자를 직접 향하도록 플라이 홀더를 회전합니다(그림 1B).
4. 실체 현미경을 통해 준비물을 관찰하면서 작고 거친 미세 조작기를 사용하여 파리의 ocelli를 통해 뭉툭한 참조 전극을 머리 캡슐에 부드럽게 삽입합니다(그림 1C). 전극을 너무 깊게 누르면 파리 뇌가 손상될 수 있으므로 전극을 너무 깊게 누르지 마십시오.
   1. 또는 기준 전극을 흉부 뒤쪽에 삽입합니다. 항상 파리가 건강해 보이고(더듬이를 움직임) 눈이 손상되지 않고 손상되지 않았는지 확인하십시오. 준비물이 흠잡을 데 없어 보이면 실험을 위해 새 파리를 준비하십시오.
5. 바셀린으로 덮인 작은 구멍을 통해 날카로운 기록 미세 전극을 왼쪽 눈으로 밀어 넣습니다. 실체현미경에서 고배율을 사용하고 광 가이드와 초점면을 이동하여 전극 팁 위치가 반사율 패턴에 의해 3D에서 분명하게 드러나도록 합니다.
   참고: 그림 1D는 광수용체 기록을 위해 파리의 머리가 어떻게 배치되어야 하는지(기록 미세 전극이 눈에 들어가는 각도와 관련하여) 보여줍니다. 전극을 부러뜨리지 않고 눈에 삽입하는 것은 실험에서 가장 어려운 단계입니다. 전극 끝이 눈의 작은 구멍을 놓쳐 각막에 부딪히면 일반적으로 부러집니다.
6. 마이크로 전극을 켭니다 amp두 전극이 파리의 체액과 전기적으로 접촉하여 두 전극이 준비물 내부에 단단히 고정되면 liifier를 liifier
.
7. 냉광원(패러데이 케이지 내부)을 끄고 주전원에서 플러그를 뽑습니다. 플러그를 중앙 접지에 연결하여 접지 루프로 인한 전기 잡음을 최소화하고 구즈넥 라이트 가이드를 멀리 이동하여 Cardan-arm 시스템이 플라이 주위를 자유롭게 이동할 수 있도록 합니다. 실내 조명을 꺼서 파리 준비물이 이제 상대적으로 어둡
도록 합니다.
8. 눈에 있는 기록 전극의 저항을 측정합니다. 저항이 100 - 250 MΩ.
   인 기록 전극만 사용하십시오. 메모: <70MΩ 전극으로 고품질 세포 내 기록을 달성하는 것은 사실상 불가능합니다. 저항이 <80MΩ이면 전극 팁이 파손되었을 수 있습니다. 이 경우 앰프를 끄고 녹음 전극을 교체하십시오.
9. 설정 amp현재 cl로amp(CC) 또는 브리지 녹음 모드. 신호 오프셋(기록 전압)을 0으로 설정하여 기록 전극과 기준 전극 사이의 임의의 전압 차이를 상쇄합니다. 다음을 사용하여 신호 오프셋 변경을 따르십시오 ampliifier의 디스플레이 판독 또는 오실로스코프 화면.
10. 플라이 아이가 어둡게 적응할 때까지 2-3분 기다립니다.
11. 0.1에서 1미크론의 작은 단계로 기록 전극 팁을 눈 깊숙이 밀어 넣습니다. 원격 제어 마이크로 매니퓰레이터의 x축 피에조 스테퍼를 사용하거나 수동 매니퓰레이터의 미세 해상도 노브를 부드럽게 회전하여 이 작업을 수행합니다.
12. 기록 전극이 조직에서 진행될 때 짧은(1 - 10 msec) 빛의 점멸로 플라이 아이를 자극합니다.
    메모: 기록 전극이 망막에 위치하고 눈이 정상적으로 기능하는 경우, 각 섬광은 전기망막검사(ERG)라고 하는 전압(0.2 - 5mV 과분극)을 짧고 작게 떨어뜨립니다. 세포 외 공간의 필드 전위에서의 이러한 변화는 빛에 대한 망막 세포의 집단 반응에 의해 발생합니다.

결과

그림 1. 실험을 위한 플라이 홀더와 전극 배치. (A-B) 플라이 홀더는 펠티에 요소(A: 중앙의 흰색 원형 플랫폼)를 통해 온도 제어를 제공하는 기록 플랫폼에 배치됩니다. Cardan-arm을 사용하면 광원(액체 또는 석영 광섬유 다발 끝단)이 눈을 직접 가리키면서 플라이 주위로 동일한 거리(x, y-회전을 통해)에서 광 자극을 정확하게 배치할 수 있습니다. 많은 굴착 장치에서 광 자극은 LED(선형 전류 드라이버 포함) 또는 모노크로메이터에 의해 생성됩니다. 따라서 이들의 자극은 300 - 740 nm 사이에서 선택되고 4 - 6 log intensity unit range(별도의 neutral density filters에 의해 감쇠됨)를 커버하는 특정(band-passed) 스펙트럼 함량을 전달합니다. (C) ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
플라이 준비를 위한 스테레오 줌 현미경	올림푸스	SZX12 DFPLFL1.6x PF 접안렌즈: WHN30x-H/22	긴 작동 거리로 ~150X 배율 가능; 맞춤형 헤비 스틸 테이블 마운트 스탠드
세포 내 설정에서의 실체현미경	· 올림푸스	올림푸스 SZX7; 접안렌즈: WHN30x-H/22	전극 끝을 작은 각막 구멍을 통해 눈으로 밀어 넣을 때 전극 끝 반사를 잘 보려면 30X 접안렌즈가 필요합니다
Nikon 현미경	니콘 SMZ645; 접안경: C- W30x/7
방진 테이블	멜레스 그리엇	브레드보드에 미터법 M6 구멍 포함	당사의 맞춤형 리그에는 두꺼운 브레드보드를 통해 뚫린 큰 구멍이 있어 아래에서 플라이 준비 플랫폼 기둥(전자 장치가 있는 구리 방열판이 있음)이
뉴포트
마이크로 매니퓰레이터	나리시게	나리시게 NMN-21	당사의 세포 내 설정에서는 성형 기록 전극을 플라이 아이로 구동하기 위해 다양한 미세 조작기 시스템이 사용됩니다. 나열된 모든 매니퓰레이터는 초파리 광수용체 및 LMC로부터 오래 지속되는 안정적인 기록을 성공적으로 제공하고 있습니다.
헉슬리 버트람	Huxley xyz-축, 정밀한 수동 제어
센스 에이펙	Sensapex 3축
메르자흐호이저	Märzhäuser DC-3K(추가 x축 피에조 스테퍼 및 MS 314 컨트롤러
마그네틱 스탠드	켜기/끄기 스위치가 있는 모든 마그네틱베이스가 가능합니다.		예를 들어, 패러데이 케이지 내부의 케이블을 관리합니다
전극 홀더	하버드 기구	ESP/W-F10N
실버 와이어	세계적인 정밀 기기	AGW1510	0.3 - 0.5 mm 직경; 전극 홀더를 위해 염소화해야 합니다.
광섬유 광원	올림푸스를 포함한 다양한
광섬유 번들	UltraFine 기술		LED 조명 자극을 Cardan 암 시스템에 전달합니다. 우리는 액체 및 석영 라이트 가이드(UV에서 IR까지의 범위)를 모두 사용합니다.
가시 연구소
플라이 케이팅 튜브		P80-50P 50ml 센트 튜브 PP., 100개 팩	50ml 플라스틱 원심분리기 튜브에서 원뿔형 바닥을 잘라내고 그 위에 1ml 피펫 팁을 붙입니다.
디지털 수집 시스템	내쇼날인스트루먼트
단일 전극 전류/전압 클램프 미세 전극 증폭기	NPI SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/ 제품/증폭기/sec-single- electrode-clamp/sec-10lx.html	뛰어난 연기자!
헤드 스테이지	표준(+/- 150nA)	npi SEC-10LX의 경우
LED 광원 및 드라이버	2채널 OptoLED(Cairn Research Ltd., 영국)		우리의 많은 경기 부양 시스템은 사내에서 구축됩니다
자체 설계 및 시공
수집 및 분석 소프트웨어	선택할 수 있는 많은 회사		Biosyst; Juusola 실험실의 실험 및 이론 작업을 위한 맞춤형 Matlab 기반 시스템
개인용 컴퓨터 또는 Mac			PC 또는 Mac이 데이터 수집 시스템 및 소프트웨어와 호환되는지 확인
카르단 암 시스템	자체 설계 및 시공		광 자극의 정확한 x, y, z 위치 지정 제공
펠티에 온도 제어 시스템	자체 설계 및 시공
패러데이 케이지	자체 건설		전자기 노이즈 차폐
필라멘트 붕규산 유리 모세 혈관		외경: 1mm
내경 : 0.5 - 0.7 mm
필라멘트 석영 유리 모세 혈관		외경: 1mm
내경 : 0.5 - 0.7 mm
피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	모델 P-2000 레이저 화염/갈색 마이크로피펫 풀러	붕규산 참조 전극의 경우 사전 설정 프로그램 #11(패치 전극)을 사용하십시오: Heat = 350; 필라멘트 = 4; 속도 36; 지연 = 200).1.2.1)입니다. 붕규산염 기록 전극의 경우, 사전 설정 프로그램 #12를 사용하십시오(이는 일반적으로 광수용체 기록을 위해 우수한 기존 샤프를 가져옵니다): 열 = 355; 필라멘트 = 4; 속도 50; 지연 = 225; 풀 = 150. 더 미세한 팁이 있는 전극이 필요한 LMC 녹음의 경우 이러한 값을 조정해야 합니다. 석영 모세관을 당기기 위해 P-2000 설명서는 프로그램을 제안합니다. 미세한 팁 미세 전극. 이러한 프로그램의 사전 설정 매개변수는 유용한 시작점으로 사용됩니다 우수한 침투 성공률과 낮은 녹음 노이즈를 가진 전극을 생성하기 위한 체계적인 수정을 위해.
Extracellular Ringer Solution for the reference electrode (기준 전극을 위한 Extracellular Ringer Solution)	Fisher Scientific의 화학 물질	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, 자당	프로토콜 섹션에서 레시피를 참조하십시오.
필라멘트 기록 미세전극을 채우기 위한 3M KCl 용액	Fisher Scientific의 소금	10010310, KCl
바셀린	바셀린

들어갈 수 있습니다 스 포함) 시리즈