고정된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호 모니터링

초록

출처: Lunsford, E. T., et al. 제브라피시에서 수영하는 동안 후방 측선 구심성 뉴런의 활동. J. Vis. 특급 (2021).

이 비디오는 마비된 제브라피시 유충에서 구심성 뉴런의 전기 신호를 측선 신경절 근처에 마이크로피펫을 배치하고 신호 캡처를 위해 느슨한 밀봉을 형성하여 기록하는 방법을 보여줍니다. 세포외 용액은 이 과정에서 신경 세포의 생존력을 유지합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 전기생리학적 기록을 위한 재료 준비

1. 실리콘 엘라스토머 바닥 녹음 접시를 만듭니다.
   1. 자가 혼합 실리콘 엘라스토머 구성 요소(예: Sylgard)의 얇은 층을 얕은 우물의 가장자리와 수평이 될 때까지 덮개 유리 바닥의 조직 배양 접시에 분배합니다. 약 0.5mL이면 충분합니다.
   2. 실온에서 최소 48시간 동안 접시를 덮고 경화시킵니다.
2. 해부 핀을 만듭니다.
   1. DC 전원 공급 장치를 사용하여 100mL 에칭액 비이커(3M KOH)에 음전하(5V)를 제공하고 텅스텐 와이어(0.002인치, 직경 50.8μm)를 양전하 출력에 연결합니다.
      주의: 음극선과 양극선은 잠재적인 화재 위험을 초래할 수 있는 스파크가 발생할 위험이 있으므로 이 절차 중에 서로 접촉해서는 안 됩니다.
   2. 팁이 날카로운 지점으로 좁아질 때까지 팁을 에칭 수조에 빠르고 반복적으로 담그어 텅스텐 와이어를 에칭합니다. 실체 현미경으로 직선 면도날로 끝에서 약 1mm 떨어진 와이어를 자릅니다. 세 번 더 반복한 다음 가는 집게를 사용하여 경화된 녹음 접시에 핀을 삽입합니다.
3. 녹음 전극을 준비합니다.
   1. 상자 필라멘트가 있는 수평 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관 튜브(내경: 0.86mm, 외경: 1.50mm)를 직경 30μm의 팁과 약간의 테이퍼(그림 1 Ai)가 있는 전극으로 당겨 후방 측선의 구심성 뉴런을 기록하는 데 사용합니다.
   2. 추가 붕규산 유리 모세관 튜브를 팁 직경이 더 작은 한 쌍의 전극(1-5μm)으로 당깁니다. 양손에 하나의 전극을 잡고 팁을 서로 가로질러 부드럽게 움직여 ~30° 각도로 부수십시오. 마이크로포지를 사용하여 베벨 팁이 부드러워질 때까지 연마합니다.
4. 전기생리학 기록 프로그램에서 프로토콜을 생성합니다.
   1. 오른쪽 헤드 stage가 미세 전극 전류 및 전압 뒤쪽의 채널 1 입력에 연결되어 있는지 확인하십시오.tage amp amp 구심성 뉴런 녹음을 위한 liifier.
      참고: 전류 및 전압 클램프 앰프에 대한 컴퓨터 사양에는 최소한 1Ghz 이상의 프로세서, Windows XP Pro 또는 Mac OS X 10.46.6, 512MB RAM, 500MB 하드 드라이브 공간 및 2개의 USB 포트가 있는 CD-ROM 드라이브가 필요합니다.
   2. 컴퓨터 제어 앰프 소프트웨어를 엽니다.
   3. IC 버튼을 클릭하여 채널 1을 전류 클램프 모드로 설정합니다.
   4. I-Clamp 1 탭에서 다음 매개변수를 입력합니다. 기본 출력: 100x AC 멤브레인 전위(100,000mV/mV), 이득: 1,000, 베셀: 1kHz, AC: 300Hz, 범위: 바이패스. 2차 출력: 100x AC 멤브레인 전위(100mV/mV), 게인: 1, 저역 통과 필터: 10Hz.
   5. 채널 매개변수를 Ch1_Aff로 저장합니다.
   6. 패치 cl을 설치하고 엽니다.amp 전기생리학 소프트웨어.
   7. 구성을 클릭하고 Lab Bench를 선택하여 BNC 동축 케이블로 연결된 디지타이저 채널(예: 아날로그 IN #0 및 아날로그 IN #1)에 Ch1_Aff 추가하여 아날로그 신호를 ampliifier의 해당 채널 1 스케일 출력에 설정합니다. 확인을 클릭합니다.
      참고: 디지타이저의 최소 컴퓨터 요구 사항은 1Ghz 이상의 프로세서, Windows XP Pro 또는 Mac OS X 10.46.6, CD-ROM 드라이브 512MB RAM, 500MB 하드 드라이브 공간 및 USB 포트 2개입니다.
   8. Acquire를 클릭하고 New Protocol을 선택합니다.
   9. Mode/Rate 탭에서 Gap Free를 선택하고, Acquisition Mode에서 Trial Length를 Use available disk space(즉, 중지될 때까지 기록) 또는 원하는 설정 Duration(hh:mm:ss)으로 설정한 다음 Sampling rate per signal (Hz)를 20,000으로 설정하여 해상도를 최대화합니다.
   10. 입력 탭에서 이전에 구성된(1.4.6단계) 아날로그 입력 채널을 선택하고 해당 채널에 대해 Ch1_Aff 선택합니다.
   11. 출력 탭에서 채널 #0 및 채널 #1에 대해 각각 Cmd 0 및 Cmd 1을 선택합니다.
       1. BNC 동축 케이블을 통해 앰프의 채널 1 명령을 디지타이저의 아날로그 출력 0에 연결합니다.
   12. 나머지 탭은 기본 설정으로 유지할 수 있습니다. 확인을 클릭하고 프로토콜을 저장합니다.

2. 솔루션 준비

1. 행크 용액을 준비하십시오 : 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na₂HPO₄, 0.44 mM KH₂PO₄, 1.3 mM CaCl₂, 1.0 mM MgSO₄, 4.2 mM NaHCO₄; pH 7.3. 스톡에 적절한 양의 탈이온수를 첨가하여 10% Hank's solution으로 희석합니다.
2. 세포 외 용액을 준비합니다 : 134 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 1.2 mM MgCl₂, 2.1 mM CaCl₂, 10 mM 포도당 및 10 mM Hepes 완충액, pH 7.8은 NaOH로 조정됩니다. 공극 크기가 0.22μm인 필터를 통해 세포외 용액을 진공 여과합니다.
3. α -bungarotoxin 준비: 동결건조된 α-bungarotoxin 1mg을 10mL 세포외 용액에 용해시켜 0.1% 희석을 생성합니다.
4. 안락사 용액 준비: 10% 행크 용액에 50%(mg/L) 완충 제약 등급 MS-222.
   주의: α-bungarotoxin은 콜린성 수용체를 차단하여 근육을 마비시키는 강력한 신경독입니다. 장갑이 필요하며 마비 환자를 다루는 동안 눈 보호구를 착용하는 것이 좋습니다.

3. 전기생리학적 기록을 위한 유충 준비

1. 제브라피쉬 유충을 움직이지 못하게 합니다.
   1. 실험실에서 사육된 제브라피쉬(Danio rerio, 수정 후 4-7일)의 유충을 사용하고 27°C에서 배아 용액(10% 행크 용액)에 사육합니다.
   2. 끝이 큰 전사 피펫을 사용하여 하우징의 유충을 작은 페트리 접시(35mm)로 옮기고 주변 용액을 최대한 많이 제거합니다.
      메모: 배아 용액을 제거하면 마비 물질의 희석을 방지하고 효능을 높일 수 있습니다. 작업용 와이프의 모서리는 남아 있는 배아 용액을 흡수하는 데 사용할 수 있으며, 유충과 접촉하거나 공기에 노출된 상태로 두지 않는 것이 중요합니다.
   3. 유충을 10μL의 0.1% α-bungarotoxin에 약 5분 동안 담그십시오.
      메모: 유충을 고정시키는 데 필요한 시간은 준비물마다 다릅니다. 건강한 제제는 지속적인 빠른 혈류와 감소된 운동 반응을 면밀히 모니터링하는 데 달려 있습니다. 마비 환자에 대한 일시적인 과다 노출은 철저한 세척 후에도 제제의 전반적인 건강이 서서히 저하될 수 있습니다. 유충이 완전히 움직이지 않기 전에 미묘한 근육 진동의 징후를 보이는 동안 세척하는 것이 가장 좋습니다.
   4. 마비된 유충을 세포외 용액으로 씻고 10분 동안 목욕시킵니다.
      메모: 유실은 유충이 미묘한 근육 진동에서 완전한 마비로 전환되도록 합니다. 또한 α-bungarotoxin은 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) α9-subunit의 길항제이며, 이는 이 프로토콜이 관찰하는 내인성 피드백 회로의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 이 효과는 10분 후 Xenopus와 제브라피시 유모 세포에서 되돌릴 수 있는 것으로 나타났습니다.
2. 기록 접시에 물고기를 고정합니다.
   메모: 유충 제브라피쉬(4-7 dpf)를 준비하는 동안 마취(예: MS-222, Tricaine)는 동물의 건강을 방해하므로 필요하지 않습니다. 사실, 애벌레 제브라피쉬는 특정 척추동물 프로토콜에서 면제됩니다.
   1. 전사 피펫을 사용하여 유충을 세포 외 용액 수조에서 실리콘 바닥의 기록 접시로 이동합니다. 접시의 나머지 부분을 세포 외 용액으로 채웁니다.
   2. 실체현미경 아래에서 끝이 가는 집게로 유충을 실리콘 매트의 중앙 위에 측면이 위로 향하게 하고 몸의 앞쪽과 뒤쪽 끝이 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 흐르도록 부드럽게 배치합니다. 그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 실리콘 매트에서 에칭된 핀을 잡고 항문에 직접 등쪽에 있는 유충의 등쪽 노토코드를 통해 실리콘에 직각으로 핀을 삽입합니다. 꼬리 끝 근처의 노토코드를 통해 두 번째 핀을 삽입하고 가스 주머니의 노토코드 등쪽을 통해 세 번째 핀을 삽입합니다(그림 1B).
      메모: 핀을 삽입할 때는 혈류를 방해하거나 주변 근육 조직을 손상시키지 않도록 노토코드 너비의 중심을 목표로 하는 것이 중요합니다. 노토코드(notochord)는 후방 측측 신경의 등쪽에 있기 때문에 적절하게 고정하면 측측 감각 뉴런에 손상이 예상되지 않습니다. 주변 조직을 방해하지 않도록 최초 접촉 후 삽입하십시오. 이상적으로는 핀의 직경이 노토코드 너비의 절반 미만으로 깨끗한 삽입을 보장하는 것이 좋습니다. 핀이 이 너비를 초과하면 원하는 핀 너비에 도달할 때까지 1.2단계를 반복합니다. 고정 후 혈류가 느려지면 새 검체로 1.3단계부터 반복합니다.
   3. 핀이 봉지재에 삽입될 때 앞쪽으로 약간 회전하면서 귀 소포를 통해 네 번째 핀을 삽입합니다(그림 1B). 약간의 회전이 적용됨에 따라 cleithrum과 otic vesicle 사이의 조직이 구심성 somata.
      메모: 네 번째 핀의 각진 삽입은 후방 측선 구심성 신경절의 노출을 보장하기 위한 것이며, 그렇지 않으면 큰 이낭에 의해 막힙니다.

4. 구심성 뉴런 기록

1. 구심성 기록 전극에 30μL의 세포외 용액을 채우고, 오른쪽 헤드 스테이지 피펫 홀더(그림 1B, C)에 삽입하고, 공압 변환기에서 생성된 양압(1-2mm Hg)을 적용하면서 식기 용액으로 내립니다.
2. 후방 외측 라인(posterior lateral line)의 구심성 신경절(centerent ganglion)을 찾아 느슨하게 부착합니다.
   1. micromanipulator를 사용하여 구심성 전극 팁이 cleithrum 위의 위치를 유지할 때까지 내립니다.
   2. 배율을 40배 침수로 높이고 후방 외측 라인 신경과 쇄골의 교차점을 찾습니다. 쇄골(cleithrum)에서 앞쪽의 측선 신경(lateral line nerve anter)을 따라가다가 섬유가 후방 측선 구심성 신경절(posterior lateral line afferent ganglion)을 신경 분포시키는 곳까지 따라가며, 이는 소마(soma)의 별개의 클러스터(cluster)로 구별됩니다(그림 1F).
   3. 전극 끝을 구심성 신경절 위로 가져오고 팁이 상피에 닿을 때까지 피펫을 내립니다. 전극을 부드럽게 움직여 전체 팁 둘레가 구심성 신경절에 닿도록 합니다.
   4. 공압 변환기로 음압(20-50mm Hg)을 가하고 유지합니다.
      메모: 구심성 신경절에 가해지는 음압은 부드럽습니다. 음압을 높이면 신호 대 잡음비가 개선될 수 있지만, 지속적인 공격적인 흡입으로 인해 구심성 뉴런 건강이 저하되어 성공적인 녹음의 확률이 감소합니다.
3. 구심성 뉴런 활동을 기록합니다.
   1. 왼쪽 헤드 스테이지는 ampamp증폭된 신호를 디지타이저로 중계하여 해당 신호를 패치 cl로 출력하는 디지타이저amp 인접 컴퓨터에서 모니터링할 전기 생리학 소프트웨어.
   2. pClamp10에서 툴바의 재생 버튼을 클릭하여 구심성 뉴런을 모니터링합니다.
   3. 구심성 뉴런의 전체 세포, 느슨한 패치 기록이 스파이크가 대략 100-200ms마다 자발적으로 발생하면 달성되도록 합니다(그림 1E).
   4. 점차적으로 구심성 뉴런 기록 전극 압력을 다시 대기(0mm Hg)로 높이고 나머지 기록 동안 유지합니다.

결과

그림 1: 후방 측선 구심성 뉴런 및 복부 운동 뿌리 활동의 동시 전기생리학적 기록. (A). 느슨한 패치 구심성 (i) 및 복부 운동 뿌리 (ii) 기록 전극의 예. 눈금 막대는 50μm를 나타냅니다. (B) 유충 제브라피쉬는 마비되어 안정성을 기록하기 위해 실가드 접시에 4개의 위치(십자 기호)에 고정됩니다. 굵은 십자 표시는 핀의 삽입 지점을 나타냅니다. (C) 전기생리학 리그는 진동 차단 테이블에 장착되며 40배 배율이 가능한 전동 컨트롤러의 직립 고정 스테이지 현미경으로 구성됩니다. 이중 전류 클램프 및 전압 클램프 헤드 스테이지는 마이크로 매니퓰레이터에 장착됩...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100mL 비커	파이렉스	1000	에칭액용 리셉터클
10x Water Immersion 대물렌즈	올림푸스	UMPLFLN10xW	유충의 위치를 파악하고 전극을 기록하기 위한 저배율
40x Water Immersion 대물렌즈	올림푸스	LUMPLFLN40XW	전극 팁 위치 및 패치 클램프 설정을 위한 더 높은 배율
BNC 동축 케이블	토르랩스	2249-C-12	증폭기 및 디지타이저 채널 연결, 4 필요
붕규산 유리 모세관 w/ 필라멘트	워너 인스트루먼트	G150F-3	내경 : 0.86, 외경 : 1.50; 기록 전극을 형성하는 데 사용되는 모세관 유리
컴퓨터	해당 사항 없음	해당 사항 없음	모든 컴퓨터가 작동해야 합니다.
DC 전원 공급 장치	텐마	72-420	해부 핀을 전기적으로 에칭하는 데 사용됩니다.
전기생리학 디지타이저	Axon Instruments, 분자 장치	축삭 디지데이터 1440A	패치 클램프 데이터 수집 가능
필라멘트	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	FB255B	마이크로피펫 풀러에 사용되는 2.5mm 상자 필라멘트
가는 집게	정밀 과학 도구	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) 제품 번호 11295-10	유충을 조작하고 핀을 삽입하는 데 사용됩니다
고정 스테이지 DIC 현미경	올림푸스	BX51WI	패치 클램프 기록을 시각화하고 설정하는 데 사용되는 현미경
유연하고 테이퍼진 피펫 팁	피셔 사이언티픽	02-707-169	유연한 팁을 통해 기록 전극에 삽입하여 팁에서 세포 외 용액을 분배할 수 있습니다.
플루오로디쉬	월드 프리시젼 인스트루먼트 Inc.	FD3510-100	뚜껑 유리 바닥 접시 기록 접시
킴와이프	(주)킴텍	34155	유충에서 과도한 체액을 흡수하는 데 사용되는 작업 와이프
퀵가드	월드 프리시젼 인스트루먼트 Inc.	710172	자체 혼합 실가드 엘라스토머
미세전극 증폭기	Axon Instruments, 분자 장치	멀티클램프 700B	듀얼 채널 녹음을 위한 패치 클램프 앰프
마이크로포지	나리시게	MF-830 마이크로포지	녹음 전극을 연마하기 위해
Micromanipulator 제어 장치	시스키유	MC1000-eR/티	micromanipulator 제어를 위한 4축 다이얼 코디네이터
마이크로피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	플레밍/브라운 P-97	모세관 유리를 기록 전극으로 끌어당기는 데 사용됩니다.
현미경 제어 장치	시스키유	MC1000e	고정된 스테이지 및 준비물 주위에 현미경을 배치합니다
전동 마이크로 매니퓰레이터	시스키유	MX7600	패치 클램프 녹음을 위해 헤드스테이지와 부착된 녹음 전극을 배치합니다
MultiClamp 커맨더	분자 장치	2.2.2	Axon MultiClamp 700B Commander 다운로드 페이지에서 다운로드 가능
광학 에어 테이블	뉴포트 코퍼레이션	VH3036W-OPT	현미경을 플로팅하고 기록 중 진동을 최소화하기 위한 브레드보드 절연 테이블
p클램프	분자 장치	10.7.0	Axon pCLAMP 10 전기생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어에서 다운로드 다운로드 페이지
페트리 접시	송골매	35-3001	유충을 마비에 담그는 데 사용됩니다
피펫 홀더	분자 장치	1-HL-U	녹음 전극을 잡고 헤드에 연결tage
공압 트랜스듀서	Fluke 생체 의학 기기	DPM1B	기록 전극 내부 압력 제어용
수산화칼륨	시그마-알드리치	221473-25지	에칭 해부 핀을 위한 Etchant
실리콘 튜빙	타이곤	14-169-1ᅡ	공압 트랜스듀서를 피펫 홀더에 연결하기 위한 튜빙
실체현미경	칼 자이스	스테미 2000-C	핀 끝을 시각화하고 유충을 준비하는 동안 사용됩니다
스트레이트 에지 면도날	카노푸스	amazon.com 에서 주문	해부 핀을 만들면서 텅스텐 와이어를 자릅니다.
주사기	Becton Dickinson 컴포니	309602	기록 전극에 주입하기 위해 세포 외 용액으로 채워짐
이송 피펫	시그마-알드리치	Z135003-500개	유충 이송을 위한 일회용, 비멸균 피펫
트리카인 메탄설포네이트	신델	12854	고용량으로 유충을 안락사시키는 데 사용되는 제약 마취제.
텅스텐 와이어	월드 프리시젼 인스트루먼트 Inc.	715500	0.002 인치, 50.8 μm 직경; 해부 핀을 만드는 데 사용됩니다.
진공 여과 장치	시그마-알드리치	SCGVU11RE	전기생리학 전극 링거에 사용되는 세포외 용액을 멸균하는 데 사용되는 일회용 멸균 진공 여과 장치
전압 클램프 전류 클램프 헤드 스테이지	분자 장치	이력서 - 7B	MultiClamp 700B와 함께 제공 amp왼쪽 및 오른쪽 헤드스테이지로 사용되는 liifier
α-bungarotoxin	써모피셔	나1601	기록하기 전에 유충을 고정시키기 위해

년 년 . 시리즈 . 시리즈 . 년 . . 년