Coronal Hippocampal Slices에서 유발된 칼륨 이온 농도 역학 측정

초록

출처: Octeau, J. C. et al. 성인 뇌의 조직 절편에서 칼륨 이온 선택적 미세 전극을 만들고, 테스트하고, 사용합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 쥐의 관상 해마 뇌 절편의 전기 자극에 대한 유발 칼륨 이온 농도 역학을 보여줍니다. 바이폴라 자극 전극은 해마의 CA3 영역의 방사선층에 삽입되고, 칼륨-이온 선택 전극은 CA1 방사선층에 배치됩니다. 전기 자극은 활동 전위를 일으켜 칼륨 이온 방출을 일으킵니다. 마지막으로, 억제 분자의 존재 하에서 유발된 칼륨 이온 반응의 부족은 칼륨 이온 농도 역학이 Schaffer 담보의 활동 전위 생성에 기인한다는 것을 확인합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 급성 해마 뇌 절편의 준비

1. 슬라이스 용액의 준비
   1. 95%_O2 및 5%_CO2로 포화된 194mM 자당, 30mM NaCl, 4.5mM KCl, 10mM D-글루코스, 1mM MgCl₂, 1.2mM NaH2PO4 및 26mM NaHCO₃, 290-300mOsm으로 구성된 500mL 자당 절단 용액을 준비합니다.
   2. 124 mM NaCl, 4.5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM D-glucose, 2 mM CaCl₂, 1.2 mM NaH₂PO₄ 및 26 mM NaHCO₃로 구성된 1-2 리터의 기록 용액 (인공 뇌척수액, ACSF)을 준비합니다. pH 7.3 - 7.4 (버블 링 후), 290 - 300 mOsm, 95 % O₂ 및 5 % CO₂로 포화. brain slice holder chamber가 들어있는 비커에 녹음 용액을 채우고 32-34 ° C로 유지하십시오.vibratome chamber를 얼음물 슬러시로 채 웁니다.
2. 급성 슬라이스 준비
   1. 2-3mL 이소플루란이 미리 충전된 벨 용기에 마우스를 넣어 심층 마취합니다. 발가락 꼬집 반사가 있는지 확인하고 반응이 없으면 동물 프로토콜에 따라 날카로운 가위나 단두대를 사용하여 신속하게 목을 베십시오.
   2. 두개골의 꼬리 부분에서 가위를 사용하여 정중선을 따라 두피를 자릅니다. 두피를 수동으로 집어넣으면서 두개골 측면을 따라 대공에서 1cm 너비로 두 번 절개합니다. 그런 다음 가는 가위를 사용하여 두개골 뒤쪽에서 코까지의 정중선을 따라 두개골 길이만큼 절개합니다.
   3. 정중선 근처에 삽입한 가는 집게를 사용하여 절개된 두개골을 두 부분으로 후퇴시킵니다. 두개골에서 쥐의 뇌를 추출하고 칼날을 사용하여 뇌의 꼬리 부분과 꼬리 부분에 각각 위치한 소뇌구와 후각구를 제거합니다. 이것들은 피질과 분리되는 큰 균열로 식별할 수 있습니다.
   4. 슈퍼 접착제를 사용하여 뇌 블록을 비브라톰 트레이에 장착합니다. 비브라톰 트레이에 얼음 냉간 절단 용액을 채웁니다.
   5. 관상동맥 평면의 조직 절편을 300μm 두께로 자릅니다. 일반적으로 6개의 관상 해마 조각을 수집할 수 있습니다.
   6. 각 섹션을 자른 후 즉시 32-34°C로 예열된 비커가 있는 슬라이스로 슬라이스를 옮깁니다. 섹션이 들어 있는 비커를 제거하기 전에 섹션을 이 온도로 20분 동안 유지하고 기록하기 전에 최소 20-30분 동안 실온에 두십시오.

2. 전기적으로 유발된 K⁺ 역학 측정

1. 슬라이스 준비 설정
   1. 파스퇴르 피펫을 사용하여 뇌 조각을 욕조에 부드럽게 넣고 나일론 현이 있는 백금 하프로 부드럽게 제자리에 고정합니다.
   2. 바이폴라 자극 전극의 끝이 서로 평행하고 슬라이스의 평면과 수평인지 확인하십시오. 천천히 6-7초에 걸쳐 약 40-50μm 깊이의 CA3 방사층에 전극을 삽입하여 Schaffer 담보를 자극합니다. 관상 절편에서 CA3는 대략적으로 해마 속의 과립 세포층 측면에 있는 해마 부분으로 식별될 수 있으며, 방사층은 피라미드 세포층의 내측과 복부로 떨어집니다.
   3. 약 3-4초에 걸쳐 전극을 천천히 내려 약 50μm 깊이의 CA1 방사선층에 K⁺-선택적 전극을 조심스럽게 삽입합니다. 슬라이스에 자극을 가하기 전에 전극 전체에 걸쳐 전위가 안정화되도록 하십시오: 일반적으로 5-10분이 소요됩니다. 슬라이스가 세포외 K⁺에서 자발적인 변화를 보이면 폐기하고 새 슬라이스로 이 과정을 반복합니다.
2. 측정 유발 K⁺ 릴리스
   1. 반응을 디지털 방식으로 기록하는 동안 자극기의 방아쇠를 수동으로 눌러 전기 자극 트레인(8개 펄스)을 적용합니다. 10 μA 자극 진폭에서 시작하여 10 Hz 및 1 ms 펄스 폭에서 자극을 적용합니다.
   2. 최대 K⁺ 응답 진폭이 감지될 때까지 자극 진폭을 2배씩 증가시킵니다. 반응이 보이지 않으면 K⁺ 전극의 위치를 100μm 단위로 자극 부위에 더 가깝게 이동합니다.
   3. 절반 최대 응답을 생성하는 자극 진폭을 결정합니다. 우리의 경험에 따르면 이것은 준비 품질, 동물의 나이, 자극 전극과 K⁺ 선택적 전극 사이의 거리에 따라 40-160μA 사이입니다.
   4. 동일한 슬라이스에서 절반 최대 응답을 생성하는 진폭보다 한 단계 낮은 자극 진폭을 사용하여(예: 80μA가 절반 최대 응답을 생성하는 경우 40μA 사용) 증가하는 펄스 수의 자극 트레인을 적용합니다. 처음에는 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 및 128 펄스의 트레인을 사용했습니다.
   5. K⁺ 신호가 전기적으로 자극된 Schaffer 담보 수조의 활동 전위 발화에 의해 매개되는지 확인하려면 ACSF에 0.5μM 테트로도톡신(TTX)을 10분 동안 적용하고 자극 프로토콜을 반복합니다. 유발된 반응은 관찰되어서는 안 됩니다.
   6. 슬라이스 실험을 마친 후 교정 용액에서 전극을 재교정하고 응답이 초기 교정에서 10% 이상 벗어나지 않았는지 확인하여 전극이 응답성을 유지했는지 확인합니다
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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
비브라톰	증권 시세	마이크로슬라이서 Zero 1
마우스: C57BL/6NTac 근친 마우스	타코닉	스톡#B6
현미경	올림푸스	BX51
p클램프10.3	분자 장치	해당 없음
맞춤형 마이크로필 28G 팁	세계적인 정밀 기기	씨엠프28G
텅스텐 막대	A-M 시스템	716000
바이폴라 자극 전극	에프씨	MX21XEW(T01)
자극 아이솔레이터	세계적인 정밀 기기	A365
잔디 S88 자극기	잔디 악기 회사	시즌 88
붕규산 유리 피펫	세계적인 정밀 기기	AN-번호 1B150-4
A to D 보드	디지데이터 1322A	축삭 기기
신호 증폭기	멀티클램프 700A 또는 700B	축삭 기기
헤드스테이지	CV-7B 고양이 1	축삭 기기
패치 컴퓨터	작은 골짜기	해당 없음
소금	시그마	S5886
염화칼륨	시그마	P3911
헤페스	시그마	H3375 (영문
중탄산나트륨	시그마	S5761
인산나트륨 Monobasic	시그마	S0751
D-포도당	시그마	G7528 (영문
염화칼슘	시그마	21108
염화마그네슘	시그마	M8266
발리노마이신	시그마	V0627-10mg
1,2-디메틸-3-니트로벤젠	시그마	40870-25ml
테트라키스 칼륨 (4-클로로페닐)보레이트	시그마	60591-100mg
헵탄에 5% 디메틸디클로로실란	시그마	85126-5ml
티엑스	케이맨 화학 회사	14964
염산	시그마	H1758-500mL
자당	시그마	S9378-5kg
피펫 Micromanipulator	셔터	MP-285 / ROE-200 / MPC-200
대물 렌즈	올림푸스	플라나포 10xW