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$$\longrightharp{xx}$$,
검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
참고: Q175 야생형(WT) 및 이형접합자(HET)의 녹음은 모든 연령과 성별에서 연주할 수 있습니다. 여기서 우리는 51주에서 76주 사이의 남성과 여성을 연구했다.
1. 부질 피질 축삭돌기에서 발현을 위한 글루타메이트 센서 iGluu 주입
- 피펫 풀러(1단계 모드)를 사용하여 바이러스 주입을 위한 붕규산 유리 피펫을 준비합니다. 당긴 후 피펫을 수동으로 부수어 30–50 μm의 팁 직경을 얻습니다. 피펫과 두개골을 열기 위한 드릴을 포함한 수술 기구를 오토클레이브합니다.
- AAV9-CaMKIIa.iGlu바이러스 저장 u. -80°C에서 10μL 분취액의 WPRE-hGH(7.5 x 1013gc/mL). 바이러스 생산 직후(6개월 이내) 주사를 하는 경우 5°C에서 유지하십시오. 수술 전에 바이알을 꺼내 실온에서 보관하십시오.
- 유리 피펫을 채우고 기포를 제거합니다.
- 87.5mg/kg 케타민과 12.5mg/kg 자일라진이 함유된 용액의 복강 내 주사로 동물을 마취합니다. 추가적인 통증 완화를 위해 0.25% 부피바카인(8mg/kg)을 피하주사합니다. 근육 긴장도를 모니터링하고 통증으로 인한 반사가 없는지 관찰하여 마취 깊이를 확인합니다.
- 머리의 피부를 면도하고 70% 알코올로 살균합니다. 마우스를 입체식 프레임에 맞춥니다.
- 메스를 사용하여 피부를 제거하고 고속(38,000rpm) 드릴을 사용하여 운동 피질 위의 뼈에 1.2mm의 구멍을 만듭니다.
- 부속된 주입 피펫이 있는 주사기를 정밀 매니퓰레이터 홀더에 장착합니다. 수직 방향의 피펫을 4개의 다른 부위에서 피질에 삽입합니다. 주입 좌표는 브레그마(mm)와 관련하여 전방 1.5, 측면 1.56, 1.8, 2.04, 2.28입니다. 경막에 대한 깊이는 (mm) : 1.5-1.7입니다.
- 주입 시스템을 사용하여 0.05μL/min의 속도로 희석되지 않은 바이러스 용액의 부위당 0.3μL를 주입합니다. 각 주입 후 피펫을 1분 동안 제자리에 두었다가 천천히(1mm/분) 빼냅니다.
- 나일론 봉합사로 수술 상처를 봉합하여 마무리합니다.
- 마우스를 원래 케이지로 되돌리기 전에 깨끗한 케이지의 가열 패드에 0.5-1시간 동안 그대로 두십시오.
- 급성 뇌 절편을 준비하기 전에 6-8주 동안 12시간 낮-밤 주기로 마우스를 유지하십시오.
메모: 세포 손상 및 시냅스 손실을 초래하는 면역 반응을 피하려면 여러 바이러스 구조체의 주입을 동시에 또는 1차 주입 후 2-3시간 이내에 수행해야 합니다. iGluu 주입을 위한 좌표는 Paxinos 및 Franklin brain atlas에 따라 선택되었습니다. 이들은 M1 운동 피질에 해당한다. 주입된 뇌의 면역염색은 ipsi- 및 contralateral striatum과 contralateral M1 및 S1 cortices에서 수많지만 대부분 잘 격리된 축삭 및 축삭 정맥류를 시각화했습니다.
2. 글루타메이트 센서 iGluu를 표현하는 글루타메이트 단자 검색
- 캘리브레이션 모드
- 다음 설정으로 sCMOS 카메라와 카메라 제어 소프트웨어를 준비합니다. Readout 페이지에서 Pixel readout rate: 560 MHz (= fastest readout), Sensitivity/Dynamic Range: bit, Spurious Noise Filter: Yes, Overlap Readout: Yes를 설정합니다. Binning/ROI 페이지에서 Full screen(전체 화면)을 선택합니다.
- 커버 슬립 아래에 5mg/mL Lucifer Yellow(LY) 한 방울이 들어 있는 유리 슬라이드를 준비합니다.
- LY 슬라이드를 63x 대물렌즈 아래에 놓고 레이저 셔터를 열고 다음 설정을 사용하여 직렬 획득을 수행합니다: 픽셀 비닝: 1x1, 트리거 모드: 내부, 노출 시간: 최소(미정).
- 레이저 출력을 조정하여 직경 4μm의 형광 스폿을 생성합니다(이미지에는 포화 픽셀이 포함되어서는 안 됨).
- 레이저 포지셔닝 시스템의 캘리브레이션을 수행하려면 레이저 포지셔닝 소프트웨어에서 다음 설정을 선택합니다: 스폿 크기 직경: 10, 스캐닝 속도: 43.200kHz. 오른쪽 패널에서 이미지 획득 시작 버튼을 클릭합니다. Runs: 0, Run delay: 0을 설정하고 Sequence(시퀀스) 페이지에서 Run at TTL(TTL에서 실행) 옵션을 선택합니다. Calibration(보정) 페이지에서 Calibrate(보정) 버튼을 클릭하고 획득 화면의 왼쪽 상단 모서리에 표시된 지침에 따라 레이저 제어 소프트웨어를 보정합니다.
- 설정이 카메라 및 레이저 제어를 위해 독립 소프트웨어를 사용하는 경우 카메라 획득 창에서 스크린샷을 획득하고 XY 좌표를 다시 계산하기 위해 레이저 제어 소프트웨어로 보냅니다. 소프트웨어가 다른 컴퓨터에 설치된 경우 비디오 그래버를 사용하여 이미지를 레이저 제어 소프트웨어로 가져옵니다. 레이저 제어 소프트웨어는 XY 스케일링 팩터 및 오프셋에 대한 정보가 필요합니다. 이를 위해 레이저 제어 프로그램의 획득 창 내에서 이미지의 왼쪽 상단, 왼쪽 하단 및 오른쪽 하단 모서리의 좌표를 결정합니다. X factor = (X bottom-right – X bottom-left)/2048, X offset = X bottom-left, Y factor = (Y top-left – Y bottom-left)/2048, Y offset = Y bottom-left 방정식에 따라 스케일링 계수를 계산합니다.
- 보정 절차가 끝나면 267x460 픽셀의 직사각형 관심 영역(ROI)을 만들고 화면 중앙으로 이동한 다음 시퀀스 시작 버튼을 클릭합니다.
- 다음 카메라 제어 소프트웨어 설정으로 돌아갑니다: 비닝: 2x2, 트리거 모드: 외부 노출, 노출 시간: 최소(미정).
- 자가형광 보정 모드
참고: 활성 시냅스 말단 환경에서 [Glu]의 휴지 수준은 일반적으로 100nM 미만입니다. 따라서 글루타메이트의 모든 센서, 특히 iGluu와 같은 낮은 친화도 센서는 시냅스 글루타메이트 방출이 없을 때 다소 어둡습니다. 그럼에도 불구하고 일부 iGluu 형광은 정지 상태에서도 검출될 수 있지만 조직 자가형광과 구별되어야 합니다. 473nm 조명은 iGluu 형광과 자가형광을 모두 유도합니다(그림 1A–C). 후자는 광범위한 파장을 차지하는 반면 iGluu 형광은 480–580nm(최대 510nm)로 제한됩니다. 자가형광에 대한 보정은 서로 다른 고역 통과 필터를 사용한 두 개의 이미지 획득을 기반으로 합니다.
- 다른 곳에서 설명한 대로 뇌 조각을 미리 준비하십시오. 밀기울 조각을 준비하십시오.
- 슬라이스를 기록 챔버로 옮기고, 125mM 염화나트륨(NaCl), 3mM 염화칼륨(KCl), 1.25mM 인산이수소나트륨(NaH2PO4), 25mM 중탄산나트륨(NaHCO3), 2mM 염화칼슘(CaCl2), 1mM 염화마그네슘(MgCl2), 10mM 포도당(pH 7.3, 303mOsm/L), 0.5mM 피루브산 나트륨, 2.8mM 아스코르브산 나트륨 및 0.005mM 글루타티온이 보충되었습니다. 1–2mL/분의 유속을 사용합니다. 수조 온도를 28–30 °C로 유지하십시오.
- 20x 침수 목표 아래에서 등쪽 선조체를 찾습니다. 조직의 움직임을 최소화하기 위해 플래티넘 하프에 나일론 그리드로 슬라이스를 고정합니다. 63x /NA 1.0 침수 대물렌즈로 전환합니다. 473 nm(다이크로익 미러)에서 빛을 반사하고 >510 nm 파장의 빛을 통과시키는 필터(방출 필터)를 선택합니다.
- 아날로그-디지털(AD)/디지털-아날로그(DA)(AD/DA) 보드를 사용하여 조명, 자극 및 이미지 획득을 해당 제어 소프트웨어와 동기화합니다. 레이저 노출 시간이 180ms이고 이미지 획득 시간이 160ms인 경우 획득을 제어하도록 트리거 프로그램을 설정합니다. 레이저 포지셔닝 장치를 사용하여 레이저 빔을 미리 결정된 수의 포인트로 보내고 스캐닝 속도 및 스폿 크기에 대한 설정을 정의합니다.
- 510nm에서 고역 통과 필터를 사용하여 자가형광 및 iGluu-positive 구조의 이미지를 획득합니다("노란색 이미지").
- 600nm에서 고역 통과 필터를 사용하여 자가형광만으로 이미지를 획득합니다("red image").
- 가장 밝은 10개 픽셀과 가장 어두운 10개 픽셀의 평균 농도를 사용하여 빨간색과 노란색 이미지의 크기를 조정하여 범위를 정의합니다. "노란색에서 빨간색 이미지를 뺀 값"을 빼기를 수행하고 빼낸 이미지를 다시 스케일링하여 관심 부통을 편리하게 시각화할 수 있도록 표준 8비트 tif 파일을 생성합니다(그림 1D). 여기에는 iGluu-positive 구조체의 밝은 픽셀, 배경의 회색 픽셀, 자가형광이 있는 구조체의 어두운 픽셀이 포함됩니다.
메모: 주어진 장비를 사용하면 평균 휴지 형광(F)이 700AU 미만이 됩니다.
- Bouton 검색 모드
참고: iGluu-positive 픽셀은 순서가 다른 축삭 가지, 분기 부위, 소포 고갈 후 정맥류 또는 완전 활성 정맥류와 같이 축삭 나무의 기능적으로 다른 요소에 속할 수 있습니다. 그러나 육안 검사만으로는 기능적 시냅스 말단을 식별하는 것이 거의 불가능합니다. 따라서 각 글루타메이터성 시냅스 말단은 전기 탈분극에 대한 반응성으로 식별해야 합니다. 자극에 반응하지 않는 부위는 폐기해야 합니다. 부신피질연축삭돌기에서 글루타메이트 방출을 유도하는 생리학적 수단은 활동 전위를 이끌어내는 것입니다. 이는 적절한 스펙트럼 특성의 채널 로돕신을 사용하거나 iGluu 자체에 의해 시각화된 축삭의 전기 자극을 통해 달성할 수 있습니다. 우발적인 옵신 활성화를 피하기 위해 후자의 approastep을 선호했습니다
- 마이크로피펫 풀러(4단계 모드)를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 자극 피펫을 생성합니다. 내부 팁 직경은 약 1μm여야 합니다. ACSF로 채울 때 전극 저항은 약 10MΩ이어야 합니다.
- 동일한 축삭돌기에 부착된 일련의 시냅스 부톤에서 글루타메이트의 활동 전위 의존적 방출을 유도하려면 63배 배율, 510nm 방출 필터 및 빼낸 이미지를 사용하여 형광 정맥류 옆에 유리 자극 전극을 배치합니다. 추가 축삭돌기의 근접을 피하십시오.
- 자극기를 켜서 탈분극 전류 펄스를 자극 피펫에 전달합니다. 약 2μA(10μA 이하)의 전류 강도를 사용합니다.
- 한 채널은 표준 수조 솔루션을 제공하고 다른 채널은 이온 채널, 수송체 또는 막 수용체의 필요한 차단제를 전달하는 다중 채널 수조 응용 프로그램 시스템을 켭니다. 기록 부위에서 흐름을 제어한 다음 테트로도톡신(TTX) 채널(수조 용액 및 1μM TTX)로 전환합니다. 2-3분 후 관심 부톤을 다시 자극하지만 지금은 활동 전위 생성이 없습니다. 이러한 방출은 전압에 의존하는 칼슘 채널을 통한 칼슘 유입에 직접적으로 기인합니다.
- 자극기의 강도 키를 돌려 자극 전류를 조정하여 활동 전위를 통해 유도된 것과 유사한 반응을 얻습니다. 일반적으로 자극 전류는 0.5ms 탈분극에 대해 약 6μA입니다.
- 제제의 기본 테스트를 위해 0.5mM CdCl2를 적용하십시오. 이 칼슘 채널 차단제 글루타메이트 방출의 존재는 시냅스 글루타메이트 방출을 완전히 방지하여 직접 유발된 글루타메이트 신호의 칼슘 의존성을 검증합니다.
메모: 다음의 일반적인 권장 사항은 선조체에서 단일 시냅스 실험의 성공률을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다. 온전한 방출 기계로 글루타메이터성 시냅스 말단을 선택하려면, 정맥류는 다음과 같아야 합니다: (i) 부드러운 방추형과 같은 모양을 가져야 합니다. (ii) 축삭돌기 분기와 관련이 없어야 합니다. (iii) "노란색 이미지"의 다른 구조보다 밝아야 합니다. (iv) 섬유관이 아닌 선조체 신경필(striatal neuropil)에 거주합니다. (v) 매우 얇은 축삭 가지에 거주합니다. (vi) 슬라이스의 더 깊은 부분에 거주하지 않습니다.
3. 글루타메이트 방출 및 제거의 시각화
- 녹화 모드
참고: 자가형광을 빼고(2.2단계) 관심 부톤의 응답성에 대한 몇 가지 초기 테스트(2.3단계) 후 데이터 수집을 시작할 수 있습니다. 단일 축삭 말단에서 글루타메이트 방출의 전기적 활성화에 대한 반응은 추가 분석 도구를 적용하지 않고도 이미지에서 직접 관찰할 수 있습니다(그림 2). 그러나 시냅스 성능의 몇 가지 기본 지표를 즉시 추출하는 것이 매우 편리하다는 것이 입증되었습니다(그림 3). 이 정보는 특정 말단 유형의 선택, HD 관련 변경의 신속한 평가, 초융합 시스템에 적용할 임상시험 또는 약물의 수와 빈도와 같은 후속 실험 과정에 대한 결정을 내리는 데 필요합니다. 결국 나타나는 아티팩트를 처리해야 할 수도 있습니다. 먼저 데이터 기록을 위한 표준 설정에 대해 설명합니다.
- 현미경 XY 드라이브를 사용하여 테스트된 iGluu-positive bouton을 시야 중앙 가까이에 놓습니다. Abort acquisition 버튼을 사용하여 이미지 획득을 중지합니다. 마지막으로 획득한 사진에서 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 정지 부통 중심의 XY 위치를 확인합니다. 설정된 커서의 XY 좌표는 수집 창의 하단 상태 패널에 표시됩니다.
- 보정 데이터(2.1.6단계)를 사용하여 iGluu 형광의 여기를 위해 레이저 빔을 보내야 하는 부위의 좌표를 계산합니다. 다음 방정식을 사용합니다: X 레이저 = X 카메라 * X 계수 + X 오프셋, Y 레이저 = Y 오프셋 – Y 카메라 * Y 계수. 이 재계산을 수행하는 동안 카메라의 수직 또는 수평 대칭 이동 설정에 주의하십시오.
- 계산된 좌표를 사용하여 레이저 제어 소프트웨어에서 1점 시퀀스를 생성합니다. 이를 위해 레이저 제어 소프트웨어의 시퀀스 페이지에 있는 시퀀스에 추가 상자에서 포인트를 선택합니다. 시작을 트리거하는 지연으로 10μs를 선택하고 레이저 펄스 시간으로 180ms를 선택합니다. 계산된 좌표로 마우스를 이동하고 왼쪽 버튼을 클릭합니다.
- 레이저 제어 소프트웨어에서 다음 설정을 선택합니다: 실행: 0, 실행 지연: 0, 시퀀스: TTL에서 실행. 그런 다음 시퀀스 시작을 클릭합니다.
- 카메라 제어 소프트웨어에서 다음 설정을 선택합니다: Binning/ROI 페이지에서 이미지 영역: 사용자 지정, 픽셀 Binning: 2x2, 높이: 20, 너비: 20, 왼쪽: 정지 iGluu-positive 스폿의 X 좌표에서 10px를 뺀 값, Bottom: 휴지iGlu u-positive 스폿의 Y 좌표에서 10px를 뺀 값, 획득 모드: Kinetic Series, Kinetic 시리즈 길이: 400, 노출 시간: 0.0003744s(최소값). 이러한 설정을 사용하면 획득 속도는 2.48kHz가 됩니다.
- 트리거 모드: 외부를 선택합니다. 카메라 제어 소프트웨어에서 신호 받기를 클릭합니다. 트리거 장치에 대해 설정된 실험 프로토콜을 시작합니다.
- 0ms – 시험 시작, 1ms – 레이저 조명 시작, 20ms – 카메라로 이미지 수집 시작, 70ms – 전기 자극 시작 1, 120 – 전기 자극 시작 2, 181ms – 시험 종료(레이저 및 카메라 꺼짐)의 타임라인으로 실험 프로토콜 시험을 구현합니다. 따라서 한 번의 시험 동안 카메라는 2.48kHz의 주파수로 400프레임을 획득합니다. 2.3.3 및 2.3.5단계를 참조하십시오. 전기 자극에 대한 자세한 내용은.
- 시냅스전 소포 풀의 충분한 회복을 위해 0.1Hz 이하의 반복 빈도로 프로토콜 시험을 적용하십시오.
- 글루타메이트의 오프라인 구축, 병리학적 시냅스 식별을 위한 글루타메이트 방출 및 청소에 대한 일시적인 신속한 평가
- 평가 루틴을 켭니다. 여기에서는 사내에서 작성한 소프트웨어인 SynBout v. 3.2를 사용합니다. (저자: Anton Dvorzhak). 그림 2의 비디오에서와 같이 iGluu 형광이 상승한 픽셀에서 ΔF/F 과도 현상을 구성하려면 다음 단계가 필요합니다.
- 부톤 크기를 결정하려면 자극이 시작되기 전에 휴지 시 ROI 형광 강도(F)의 평균과 표준 편차(SD)를 계산합니다. 픽셀이 차지하는 영역을 F>mean + 3 SD로 확인하고 boxing합니다(그림 3A). 가상 직경(μm)을 결정하고, supra-threshold area의 원형 형태를 가정합니다.
- ΔF를 피크 강도 값과 F의 차이로 측정합니다. 시간에 대한 자극 전류와 ΔF/F를 표시합니다(그림 3B). 정지 상태(자극 시작 전)의 ΔF/F의 SD와 "피크 진폭"을 계산합니다. 피크 진폭이 ΔF/F의 3SD보다 큰 픽셀을 사용하여 피크로부터의 감쇠에 대한 단지수 피팅을 수행합니다. ΔF/F의 감쇠 TauD의 시간 상수를 결정합니다.
- 주어진 시냅스에서 "최대 진폭"을 추정하려면 ΔF/F 값이 가장 높은 픽셀을 선택하십시오. 일반적으로 휴지 부톤 iGluu 형광의 경계 내부 또는 옆에 위치합니다. "최대 진폭"은 단일 시냅스의 제거 기계에 제시된 글루타메이트 부하의 가장 좋은 지표가 될 것입니다.
