쥐의 여러 부위에서 뇌 활동에 대한 생체 내 전기생리학적 기록

초록

출처: Haumesser, J. K., et al. Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats. J. Vis. 특급.(2017).

이 비디오는 여러 부위의 뇌 활동에 대한 전기 생리학적 기록을 위해 마취된 쥐를 준비하는 자세한 절차를 보여줍니다. 두개골에 접근하기 위해 두피를 절개하고, 정확한 위치에 구멍을 뚫어 전극을 설치하고 고정합니다. 그런 다음 텅스텐 마이크로 와이어 전극을 대상 위치에 삽입하여 데이터를 기록합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술

1. 전기 생리학적 기록의 경우 마취에 우레탄(주의)을 사용하십시오.
   주의: 우레탄은 독성이 있고 발암성이 있으므로 항상 물질 제조업체가 제공한 안전 규정 및 데이터 시트를 준수하십시오.
2. 0.9% 염화나트륨(NaCl) 의료용 식염수에 200mg/mL 우레탄 용액을 준비합니다.
3. 총 1.3g/kg 체중 우레탄을 복강내(IP)로 투여합니다. 쥐 균주에 따라 마취의 안전성을 높이기 위해 주사 사이에 15분 간격으로 용량을 두 가지 용량으로 나누
는 것이 합리적일 수 있습니다.
4. 페달 철수 반사 및 기타 적절한 반사를 사용하여 마취 깊이를 확인하십시오. 마취가 수술을 할 만큼 깊지 않은 경우 체중 0.15g/kg의 우레탄 IP를 주입하고 15분 더 기다립니다.
5. 각막 탈수를 예방하기 위해 안연고를 바르십시오.
6. 마취 중 호흡수와 페달 인출 반사를 지속적으로 모니터링합니다. 온도 조절 기능이 있는 소형 동물 발열 패드를 사용하여 수술 내내 생리적 체온이 유지되도록 합니다. 전기생리학적 기록을 시작하기 전에 비전기적 대안(예: 아세트산나트륨 헤드 패드)으로 변경하십시오.
7. 깨끗한 수술 영역을 만들기 위해 머리의 등쪽 쪽을 따라 털을 면도합니다. 절개 부위 주변을 적절한 외과용 소독제로 소독합니다. 정위 프레임에 동물을 고정하십시오.
8. 메스로 두피를 시상 방향으로 2cm 길이로 절개합니다. 메스를 사용하여 두개골 aponeurosis를 약간 긁어내고 두개골을 소독합니다. 3% 과산화수소(H₂O₂)에 적신 면봉을 사용하여 남아 있는 조직을 제거합니다.
9. 필요한 경우 전기 처리기 또는 온도 조절기를 사용하여 출혈을 조절합니다. 두개골 뼈와 피하피에서 출혈이 멈추고, 1-2분 후에도 출혈이 자발적으로 멈추지 않고 두개골이 시야에 방해가 되는 경우.
10. 머리가 평평한 두개골 위치에 위치할 때까지 앞니 막대를 조정하는데, 이는 입위 기준점으로서의 브레그마와 람다가 같은 평면에 있음을 의미합니다. 이것은 높은 수술 정밀도를 달성하는 데 가장 중요합니다. 표준 입체 래드 정렬 도구를 사용하고, 현미경 시야에서 지정된 팁을 브레그마로 보정하고, 도구의 브레그마와 람다에 대한 지정된 지점이 동시에 두개골에 닿을 때까지 앞니 막대를 조정합니다.
    메모: 한 쪽에서 보는 관점과 다른 쪽에서 집중된 조명이 이 상태를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또는 미세한 캐뉼라가 있는 입체성 홀더를 사용하여 현미경 시야에서 Bregma와 lambda의 배복부 좌표를 측정합니다. Bregma와 lambda의 배복부 좌표가 같아질 때까지 앞니 막대를 조정합니다.
11. 캐뉼라가 있는 입체성 홀더를 사용하여 브레그마로 보정한 다음 두개골에 있는 모든 드릴 구멍의 위치를 계산합니다. 입체 홀더를 사용하여 두개골을 조심스럽게 긁거나 수술용 색상 마커를 사용하여 뚫을 구멍의 위치를 표시합니다. 이에 대한 좌표는 대상에 따라 다릅니다. 브레그마(bregma)와 관련된 좌표는 소뇌 참조 전극(cerebellar reference electrodes)에 대해 제안된 좌표를 포함하여 표 1의 초간접 경로(hyperdirect pathway)에 대해 제공됩니다.
12. 마이크로 드릴을 사용하여 모든 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 시상하핵(STN) 및 흑질핵(SNr)의 경우 공통 구멍(약 2mm x 3mm 크기)을 뚫습니다. 다른 모든 드릴 구멍은 직경이 약 1mm여야 합니다.
13. 두 개의 미세한 캐뉼러(최소 27G)를 잡고 단단한 표면이나 핀셋을 사용하여 팁을 구부려 갈고리 모양을 만듭니다. 이를 사용하여 드릴 구멍에서 이물질을 제거하고 일반적인 STN/SNr 구멍에서 경막을 조심스럽게 잘라 제거합니다.
14. 생리식염수로 드릴 구멍을 씻어냅니다. 뇌와 경막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 15분마다 드릴 구멍에 생리식염수 한 방울을 떨어뜨립니다.
15. 마이크로드릴과 일치하는 스테인리스강 마이크로 나사(예: M 1.2mm x 2mm 나사)를 사용하여 구멍을 뚫고 소뇌 위의 기준 경막외 전극의 드릴 구멍 사이에 마이크로 나사를 조이고 M1 경막외 전극에 대해서도 동일한 작업을 수행합니다.
16. 자체 제작된 Ag/AgCl 경막외 전극을 기준 전극 및 M1 전극의 드릴 구멍에 밀어 넣습니다. 가는 핀셋으로 전극 끝을 안내하고 두개골 뼈 바로 아래에 있는 드릴 구멍으로 밀어 넣습니다.
17. 모든 경막외 전극을 2액형 치과용 아크릴로 고정합니다. 브레그마 포인트를 덮거나 일반적인 STN/SNr 구멍에 영향을 미치지 않도록 하십시오.
18. 텅스텐 마이크로와이어 전극이 있는 준비된 홀더를 입체성 프레임에 삽입합니다.
19. STN을 표적으로 하는 대부분의 복부 전극을 브레그마로 보정합니다. 일반적인 STN/SNr 구멍 위의 계산된 위치에 맞추고 현미경 시야 아래에서 전극을 뇌까지 내립니다. 텅스텐 마이크로 와이어 전극이 뇌 내부로 원활하게 들어가는지 확인하십시오.

2. 전기생리학적 매핑 및 기록

참고: 이 단계에서는 패러데이 케이지와 온라인 필터링 및 온라인 스파이크 분류가 가능한 기록 소프트웨어가 있는 다중 채널 전기생리학적 기록 시스템이 필요합니다. 가급적이면 동물의 머리 근처에 위치한 프리앰프와 함께 작동하는 시스템을 사용하여 전기 노이즈와 아티팩트를 절대적으로 최소한으로 유지하는 것이 좋습니다. 텅스텐 마이크로와이어 전극 외에도, 적어도 하나의 경막외 전극과 하나의 기준 전극이 초직접 경로의 기록을 수행하는 데 필요합니다. 경막외 전극과 참조 전극을 서로 닿지 않도록 쌍으로 삽입하는 것이 좋으며, 이는 오작동 시 도움이 되며 데이터 분석에서 다양한 유형의 참조를 허용합니다.

1. 이동식 패러데이 케이지를 입체식 프레임 위에 놓습니다. 고정식 패러데이 케이지만 사용할 수 있는 경우, 정위 프레임이 최종 위치에 있을 때까지 뇌 심부 전극이 뇌 안으로 내려가지 않도록 하면서 정위 프레임을 패러데이 케이지로 조심스럽게 이동합니다.
2. 전극을 헤드스테이지에 연결합니다.tage 전기생리학적 설정의. 기준 전극이 적절한 기준 채널에 연결되어 있는지 확인하십시오.
3. 녹음 소프트웨어 설정: 대역통과 필터(0.05-8,000Hz) 및 증폭(1,500-2,000배 이득)원시 데이터 신호. 적절한 설정(LFP의 경우 대역통과 필터 0.05-250Hz, MUA의 경우 대역통과 필터 300-8,000Hz)과 함께 온라인 LFP 및 스파이크 필터를 사용합니다. 모든 필터에는 버터워스 유형 필터를 사용합니다.
4. 해당되는 경우 온라인 스파이크 정렬을 위해 스파이크 임계값을 설정합니다. 대부분의 녹음 소프트웨어는 스파이크 임계값을 설정할 수 있으며, 이는 소프트웨어가 신호를 스파이크로 표시하는 진폭 값입니다. 이 임계값은 필터링된 스파이크 신호의 평균 진폭의 계수 또는 표준 편차로 수학적으로 결정될 수 있거나, 바람직하게는 데이터 세그먼트의 육안 검사<500ms에 의해 결정되고 그래픽 사용자 인터페이스에서 신호 노이즈 위의 선으로 설정될 수 있습니다.
   메모: 스파이크 임계값을 설정하는 목적은 스파이크를 계산하고 단위를 정렬하여 현재 기록된 뉴런의 수와 스파이크의 모양에 대한 정보를 제공하는 것입니다.
5. 텅스텐 마이크로와이어 전극을 초직접 경로에 대한 STN인 대상의 등쪽 1mm까지 천천히 내립니다. 필요한 경우 신호가 안정화될 때까지 기다립니다.
6. 전기생리학적 매핑을 위해 전극을 100μm 단위로 복부 방향으로 전진시킵니다. 각 단계에서 스파이크의 발사 패턴, 발사 속도 및 모양을 평가합니다. 그림 1에 제공된 일반적인 예제와 비교해 보십시오. 일반적으로 조밀한 핵은 여러 배복부 단계에서 빠르고 지속적인 스파이크를 보이는 반면, 섬유가 풍부한 구조는 후속 배쪽 단계에서 낮은 발사 속도와 덜 균일한 스파이크 활성을 보여줍니다.
7. 초직접 경로의 경우 대부분의 복부 전극이 STN.
   내부에 있는지 확인하십시오. 메모: STN은 Zona incerta의 복부에서 MUA의 상당한 증가가 감지될 때 도달합니다. STN의 복부에서 스파이크는 전극이 내부 캡슐에 도달했기 때문에 거의 완전히 멈춥니다. 대부분의 복부 전극이 STN에 있을 때 텅스텐 미세 전극의 구성은 후방, 두 번째 전극이 SNr에 있도록 합니다. STN과 SNr에서 일반적인 MUA를 동시에 기록하기 위해 작은 증분으로 배쪽 미세 조정이 필요할 수 있습니다. MUA의 빈도는 실제로 기록된 뉴런의 수와 뇌 활성화 수준에 따라 달라집니다.
8. 전극이 원하는 구조에 들어가면 온라인 필터링 및 스파이크 정렬을 설정한 다음(그림 2 참조) 데이터 기록을 시작합니다. LFP 기록에서 식별될 수 있는 다양한 피질 동기화 상태에 대한 일반적인 예가 그림 3에 나와 있습니다.

표 1: 초직접 피질-기저 신경절 경로의 기록을 위한 입체성 좌표. 모든 점은 두개골의 브레그마 기준점에서 mm 단위로 측정됩니다. N.A.- 해당 없음.

브레그마(Bregma)의 좌표	역	SNr	엠1	참조 1	참조 2
전방-후방	-3.6	-4.8	+3.0	-10.0	-10.0
내측-외측	+2.5	+2.5	+3.0	+3.0	-3.0
등쪽-복부	-8.0	해당 없음	해당 없음	해당 없음	해당 없음

결과

그림 1: STN을 표적으로 하는 배복부 전극 궤적의 특징적인 다중 유닛 활성. (A) 복부 후내측 시상핵(VPM), 조나 인서타(ZI), 시상하핵(STN) 및 시상하핵(substantia nigra pars reticularis, SNr)의 다중 단위 기록. VPM은 희박하고 불규칙한 간격의 높은 진폭 스파이크를 나타냅니다. 이러한 스파이크 패턴은 ZI에 접근할 때 멈춥니다. 전극이 STN에 들어가면 중간 진폭의 짧은 버스트를 가진 일반적인 고주파 발사 패턴을 관찰할 수 있습니다. SNr은 높은 진폭과 규칙적인 발사 패턴으로 식별할 수 있습니다. (B) 쥐 입체 전술 atlas21의 이미지에 중첩된 STN-궤적. 상부 : 코로나 평면. 하부: 시상면. 전극 팁이 VPM 및 ZI를 통과하는 것에 주목하십시오.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ag/AgCl 맞춤형 경막외 전극	굿펠로우 GmbH D-61213 바트 나우하임, 독일 info@goodfellow.com	99.99% 은선에 대한 제품 ID AG005127	Ag/AgCl 전극은 더 나은 신호 품질을 허용하지만 급성 실험에만 사용할 수 있습니다. 교체 가능: 스테인리스강 전극
아크릴 블록이 있는 입체식 홀더	데이비드 코프 인스트루먼트, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, 미국	제품 ID 모델 1770 표준 전극 홀더	아크릴 블록에 원하는 대상에 대한 전극 설정에 적합한 홈이 있는지 확인하십시오. 아크릴 블록은 원하는 구성을 얻기 위해 파일로 쉽게 수정할 수 있습니다. 교체 가능: 자체 제작된 전극 홀더
텅스텐 마이크로 와이어 전극 1.5MΩ 임피던스	Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879, 미국	제품 ID WE3ST31.5A5-250um	1.5MΩ은 MUA와 LFP를 동시에 기록하는 데 필요합니다. 가능한 교체: 다양한 재료의 미세 전극을 사용할 수 있습니다. 전극은 곧고 견고하며 가능한 한 얇아야 합니다.
쥐 정렬 도구	데이비드 코프 인스트루먼트, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, 미국	제품 ID: 모델 944, 쥐 정렬 도구	뇌의 정확한 방향이 입체 아틀라스와 일치할 수 있습니다. 가능한 교체: 캐뉼라가 있는 입체성 홀더
2액형 치과용 아크릴	Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, 스윈던 Wiltshire, SN5 4HT, 영국	심플렉스 래피드 파우더 클리어 225g, 제품 코드: ACR803; 심플렉스 래피드 리퀴드 150ml, 제품 코드: ACR920	사용되는 전극에 따라 전극이 작고 가벼운 경우 초강력 접착제가 쉬운 대안이 될 수 있습니다. 가능한 대체품: 초강력 접착제(시아아크릴레이트 기반)
패러데이 케이지	자체 건설		적절한 패러데이 케이지는 전자기 인공물로부터 가장 잘 보호하지만 상자 모양으로 형성하거나 프레임에 적용할 수 있고 전도성 재료로 만들어진 모든 것이 도움이 될 수 있습니다. 가능한 교체 : 알루미늄 호일 또는 구리 메쉬
기록 소프트웨어 및 온라인 스파이크 분류 기능을 통한 전기생리학적 설정	OmniPlex® 신경 데이터 수집 시스템 플렉슨 Inc 6500 그린빌 애비뉴, 스위트 700 댈러스, 텍사스 75206 미국		오프라인 분류 소프트웨어는 잠재적인 대안이며 여러 스크립트와 소프트웨어는 오픈 소스 커뮤니티에서 무료로 찾을 수 있습니다.