전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편의 신경 활동에 대한 광학 기록

초록

출처: Tominaga, Y., et al. 전압 민감 염료를 사용한 뇌 절편의 광시야 단일 광자 광학 기록. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편에서 신경 활동의 변화를 관찰하는 절차를 보여줍니다. 염료는 형광 강도를 변경하여 뉴런의 막 전위의 변화를 반영합니다. 전기 자극과 고급 이미징 기술의 적용을 통해 이 프로세스를 통해 VSD 형광을 기반으로 신경막 전위의 실시간 변화를 시각적으로 추적할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 실험기구의 일일 준비

1. 켜다 ampliifier, 컴퓨터 및 카메라 시스템을 확인하고 소프트웨어가 실행 중인지 확인합니다.
2. 인공 뇌척수액(ACSF)을 50mL 튜브에 넣고 발암물질로 거품을 냅니다.
3. 연동 펌프를 사용하여 ACSF를 순환시킵니다. 유속을 약 1mL/분으로 조정합니다.
4. 실험실 내부의 액체 레벨이 항상 일정하도록 흡입 피펫의 높이를 조정합니다.
   메모: 안정적인 기록을 얻으려면 용액의 수준이 중요하므로 미세 조작기를 사용하여 조정해야 합니다.
5. 3M KCl 한천(2%)으로 채워진 노란색 칩으로 구성된 접지 전극을 소량의 3M KCl 용액이 있는 Ag-AgCl 와이어가 있는 홀더에 설치합니다.
6. 테이퍼되고 얇은 튜브가 있는 노란색 팁을 사용하여 유리 전극(외경 1mm, 마이크로피펫 풀러로 당긴 내경 0.78mm)에 소량의 ACSF(부피의 약 2/3)를 채우고 전극 홀더에 놓습니다.
7. 매니퓰레이터에 설치된 로드에 홀더를 부착합니다. 전극 저항이 약 1MΩ.
   인 liifier를 사용하여 확인하십시오. 메모: 긴 생크 넓은 개구부(4-8μm 개구부) 패치 유형 전극은 현장 기록 및 자극 전극으로 적합해야 합니다.

2. 녹음 세션 시작

1. 집게로 촉촉한 챔버에서 슬라이스 준비를 취하십시오.
2. 현미경 아래의 실험실에 슬라이스를 빠르게 놓습니다(그림 1).
3. 링의 가장자리를 실리콘 O-링에 단단히 밀어 넣습니다. 멤브레인이나 실험실의 바닥이 파손되지 않도록 주의하십시오.
   메모: 슬라이스의 방향은 시야에서 자극 및 기록 전극의 방향과 관련하여 고려해야 합니다. 건강한 슬라이스는 멤브레인 필터에 달라붙어야 하므로 웨이트 및 나일론 메쉬와 같은 슬라이스를 고정하기 위해 다른 장치를 사용할 필요가 없습니다.
4. 자극 전극의 끝과 전계 전위 기록 전극을 투과광으로 현미경 아래 슬라이스에 놓습니다.
5. 전기생리학적 기록 시스템을 사용하여 반응을 확인합니다. 주어진 구성으로 일반적인(염색되지 않은) 전기생리학적 기록을 확인합니다.
   메모: 기록 전극은 생략할 수 있지만 슬라이스의 생리학을 확인하는 데 유용합니다.
6. 5x 침수 대물 렌즈와 1x PLAN APO 튜브 렌즈를 사용하여 10kHz에서 샘플링할 때 표본에서 13-15mW/cm²에 해당하는 카메라에서 여기광 강도를 최대 용량의 약 70-80%로 조정합니다. 여기광 파장은 530nm이고 방출 필터는 590nm> 해야 합니다.
   메모: 셔터를 사용하여 여기광의 양을 최소화합니다. 지속적인 빛 노출은 슬라이스의 생리를 악화시킬 수 있습니다. 빛의 가능한 유해한 영향은 빛의 강도와 지속 시간에 따라 다릅니다. 전기생리학적 기록을 사용하여 빛의 효과를 판단합니다. 강도가 13-15mW/^cm2인 경우 약 1초 노출이 허용 오차의 상한이 되어야 합니다.
7. 파장에 따라 초점이 달라질 수 있으므로 형광등을 사용하는 획득 시스템으로 초점을 조정하고 획득을 시작합니다.
8. 이미지 획득 소프트웨어에서 데이터를 검사합니다.
   메모: 우리는 상세한 분석을 위해 수치 해석 소프트웨어의 독창적인 마이크로프로그래밍 패키지를 사용했습니다.

결과

그림 1. 슬라이스 준비의 광 신호를 위한 기록 시스템. (A) 현재 원고의 절편을 이미지화하는 데 사용된 현미경 사진. 광학 장치는 대물 렌즈(5x NA0.60), 이색성 필터용 미러 박스(580nm) 및 프로젝션(튜브) 렌즈(PLAN APO x1.0)로 구성됩니다. 고속 카메라는 C-마운트를 통해 프로젝션 렌즈 상단에 부착됩니다. 관찰을 위한 또 다른 일반적인 USB 카메라가 있습니다. 여기광은 광섬유를 사용하여 도입됩니다. (B) 미러 박스와 호환되는 렌즈의 사진. (C) 기록 시스템의 개략도. 이미징 시스템과 전기 생리학적 기록 시스템은 PC에 의해 제어됩니다. 포토 다이오드 피드백 제어 시스템이 있는 LED 조명 시스템이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고속 이미지 획득 시스템	공급자:Brainvision co. Ltd.	MiCAM - 울티마	이미징 시스템
고속 이미지 획득 시스템	공급자:Brainvision co. Ltd.	미캠 02	이미징 시스템
광시야 이미징을 위한 Macroscepe	공급자:Brainvision co. Ltd.	THT 매크로스코프	매크로스코프
포토 디오도드 안정 장치가 있는 고성능 LED 조명 시스템	공급자:Brainvision co. Ltd.	렉스-2G	LED 조명
이미지 획득 소프트웨어	공급자:Brainvision co. Ltd.	BV-아나	이미지 획득 소프트웨어
다기능 전기 자극기	공급자:Brainvision co. Ltd.	동부 표준시 - 8	자극 아이솔레이터 + AD/DA 컨버터
슬라이스 지지를 위한 멤브레인 필터	Merk Millipore Ltd., 매사추세츠, 미국	다용도, JHWP01300, 0.45μm 모공,	멤브레인 필터/ 0.45 13
수치 해석 소프트웨어	Wavemetrics Inc., 오리건, 미국	이고프로(IgorPro)	분석 소프트웨어
자극 아이솔레이터	WPI 주식회사	A395	자극 아이솔레이터
AD/DA 컨버터	인스트루텍	ITC-18 (영문	AD/DA 컨버터
전압 민감형 염료 Di-4-ANEPPS	Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬	카탈로그 번호: D-1199	VSD: 디-4-아넵스
폴리에톡실화 피마자유(Polyethoxylated castor oil)	시그마-알드리치	크레모퍼 EL C5135	폴리에톡실화 피마자유(Polyethoxylated Castor Oil)

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