생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

초록

출처: Jarriault, D., et al. 온전한 신경 상피에서 마우스 후각 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 기록: 식별된 냄새 수용체를 발현하는 뉴런의 기능 분석. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. Jackson Laboratory에서 구할 수 있는 유전자 조작 OR-IRES-tauGFP(OR = 후각 수용체, IRES = 내부 리보솜 진입 부위, tauGFP = 타우-녹색 형광 단백질) 마우스를 사용합니다. 이 마우스는 Peter Mombaerts 박사의 실험실에서 축삭돌기 표적화 및 후각 시스템의 발달을 분석하기 위해 개발되었습니다. 예를 들어, MOR23-IRES-tauGFP 라인(재고 번호 006643)은 공식 균주 이름 B6을 갖습니다. 129P2-OLFR16TM2엄마/엄마J; 마찬가지로 SR1-IRES-tauGFP 라인, 재고 번호 6717은 공식 이름 B6을 갖습니다. 129P2-OLFR124TM1엄마/엄마J.
2. 동물의 나이에 관하여: 프로토콜의 더 나은 결과를 위해 생후 2주에서 4주 사이의 동물을 사용하십시오. 이 연령대에서는 해부가 더 쉬우며(뼈가 더 부드럽고 후각 상피가 더 단단함) 수지상 손잡이가 나이가 많은 동물에 비해 더 큽니다.

2. 전극 및 용액 준비

1. 자극 피펫의 경우: 미리 당겨진 자극 피펫을 구입하십시오. 그렇지 않으면 수동으로 준비하십시오.
   1. 화염을 사용하여 1mm 유리 피펫 6개를 끝에서 약 1cm 떨어진 곳에 구부립니다. 이 6개의 피펫과 직선 7번째 피펫을 구멍으로 강화된 1.5cm 열수축 튜브에 삽입합니다.
   2. 열은 튜브를 수축시켜 함께 부착된 배럴을 유지합니다. 배럴의 다른 쪽 끝에 추가 열수축 튜브를 부착합니다. 이 자극적인 피펫을 멀티 배럴 풀러로 당기십시오.
   3. 구부러진 팁을 강화하기 위해 구멍 주위에 흰색 액체 접착제를 추가합니다. 밤새 말리십시오 (O / N).
2. 1 또는 2 L의 일반 Ringer's extracellular solution(mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃ 26, NaH₂PO₄ 1.25, 포도당 15, pH 7.6 및 305 mOsm)을 준비합니다. 사용할 때까지 4 °C를 유지하십시오.
3. 세포 내 원액 제조 (mM) : KCl 70, KOH 53, 메탄 술폰산 30, 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA) 5, 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) 10, 자당 70; pH 7.2 (KOH) 및 310 mOsm. 사용할 때까지 4 °C를 유지하십시오. 몇 주 동안 좋습니다.
4. 실험 전에 즉시(마지막 순간에) nystatin이 포함된 세포 내 기록 용액을 준비합니다.
   1. nystatin의 3 mg의 무게를 달고, dimethyl sulfoxide (DMSO)의 50 μl를 추가하십시오; 와류 20 초는 그 후에 완전히 묽게 될 때까지 2-3 분 초음파 처리한다.
   2. 세포 내 원액 5ml에 DMSO-nystatin 용액 20μl를 추가합니다. 소용돌이 20 초, 그 후 3 분 초음파 처리. 이 용액을 4°C로 유지하고 직사광선으로부터 보호하십시오, 니스타틴은 빛에 민감합니다. 이 솔루션은 몇 시간 동안 사용할 수 있습니다. 매일 교체하십시오.
   3. 일단 후각 상피 준비물이 현미경의 밑에 있으면, 전극을 채우기 위하여 화염 길쭉한 노란 끝을 가진 1개 ml 주사기에 있는 이 해결책의 몇몇을 가지고 가십시오; 직접적인 빛에서 보호하십시오. 실온(RT)에 도착하면 니스타틴 용액이 안정적이지 않습니다. 매시간 1ml 주사기에 담긴 용액을 교체하거나 얼음 속에 보관하십시오.
5. 풀러로 기록 전극을 당겨 내부 니스타틴 용액으로 15-20MΩ의 저항으로 긴 목과 작은 팁(~2μm)을 얻습니다.
6. 흄 후드 아래 DMSO에서 0.5M의 냄새 용액을 준비하십시오. 분취하고 사용할 때까지 -20 °C를 유지하십시오. 원하는 농도가 될 때까지 Ringer's solution에 냄새 물질을 희석합니다. 자극 피펫을 채웁니다.

3. 후각 상피의 준비

참고: OR-IRES-tauGFP 마우스는 OR promoter의 제어 하에 tauGFP를 발현합니다. 이 마우스에서는 관심 OR을 발현하는 모든 뉴런이 GFP로 표지됩니다. 이 프로토콜은 모든 영역에서 표현되는 OR에 맞게 조정됩니다. 그러나 해부 및 기록은 등쪽 영역에서 발현되는 OR에 대해 더 쉽습니다.

1. 케타민과 자일라진(각각 체중 150mg/kg 및 체중 10mg/kg)의 혼합물을 주사하여 동물을 마취합니다. 참수는 어린 쥐의 경우 날카로운 가위로, 나이 든 쥐의 경우 적절하게 유지 관리되는 설치류 단두대로 수행할 수 있습니다.
   1. 고리 절개 가위를 사용하여 등쪽 피부를 통해 세로 내측 절개를 만듭니다. 피부를 당겨 제거하십시오. 가위를 사용하여 아래턱 관절을 자릅니다. 치아와 평행하게 절단된 관상동맥으로 위쪽 앞니를 제거합니다.
   2. 눈 뒤의 머리를 관상 절개하고 머리의 앞부분만 유지합니다. 내시경 아래를 해부하기 위해 얼음처럼 차가운 Ringer 용액에 담그십시오.
2. 내시경 아래 해부: 복부 쪽에서 위턱/치아를 따라 세로로 자릅니다. 비강의 배외측을 따라 등뼈를 세로로 자릅니다. 대부분의 뼈와 입천장을 제거하십시오. 중격과 그것에 부착된 상피를 RT에서 산소화된 Ringer로 전달합니다.
3. 최종 해부: 녹음 세션을 시작하기 직전에 집게로 밑에 있는 중격에서 상피를 벗겨냅니다. 겸자와 접착력이 더 강한 중격의 앞쪽 부분에서 두 개의 4-5mm 가위 절단 (마이크로 반나스 가위 사용)으로 상피를 분리합니다.
   1. 중격 상피에 대한 등쪽 연결을 따라 잘라내어 성비강 기관을 조심스럽게 제거합니다. 점액층이 위를 향하도록 상피를 기록 챔버로 옮기는 단계; 하프와 함께 챔버에 평평하게 보관하십시오.
4. 형광 광학 장치와 민감한 카메라가 장착된 정립 현미경 아래에 챔버를 설치합니다. 40X 침수 대물렌즈(개구수 0.8)와 확대 렌즈로 얻은 추가 2X 또는 4X 배율을 통해 고배율로 컴퓨터 화면에서 준비물을 시각화합니다. 산소가 공급된 Ringer를 RT(1-2 ml/min)에서 지속적으로 관류합니다.

4. 녹음 세션

1. 형광성 세포를 찾으십시오: 530-550 nm 범위에 있는 빛을 방출하는 EGFP를 위한 480 nm에 준비를 흥분하십시오; 형광에서 그리고 명시야의 밑에 믿을 수 있 보이는 1개의 수지상 손잡이를 표적으로 하십시오.
2. 세포내 용액으로 전극에 니스타틴을 채우고, 전극을 부드럽게 두드려 기포를 제거합니다.
3. 전극 홀더에 전극을 삽입하고 피펫에 양압을 가하십시오. 저항은 15-20MΩ이어야 합니다.
4. 전극을 셀 가까이로 가져오십시오. 저항이 ~40MΩ에 도달하면 양압을 해제하고 약간의 음압을 가하여 기가씰에 도달합니다.
5. 씰에 도달하면 멤브레인 전위를 약 -75mV로 설정합니다.
6. 세포가 열리면 자극 프로토콜, 약물 치료를 진행하십시오. 단일 냄새 자극에 대한 반응을 측정하려면 200-500msec의 자발적 활동을 기록하고 500msec 동안 자극하며 최대 10초 동안 세포의 반응을 측정합니다. 약리학적 치료를 위해 약리제를 원하는 농도로 관류하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
중장비
패러데이 케이지가 있는 진동 테이블	티엠씨	63-500 시리즈	필수 : 환경에 의해 유발 된 진동 (실험자의 움직임, 냉각 컴퓨터 용 팬과 같은 장비의 진동 등)으로부터 기록 시스템을 격리합니다. 패러데이 케이지와 함께 구입하거나 맞춤형 패러데이 케이지를 장착 할 수도 있습니다.이 케이지는 환경의 전기 소음을 피하기 위해 권장됩니다.
광학
현미경	올림푸스	BX51WI	epifluorescence가 장착된 Upright Microcope; 사용자의 선호도에 따라 고정 또는 이동하는 단계
목표	올림푸스	LUMPLFL40XW	최소 2개의 대물렌즈 필요: 세포에 대한 거친 접근을 위한 4X 또는 10X; 및 40X 침수 장거리 예시 Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM
돋보기	올림푸스	TVCAC 시리즈	ABSOLUTELY REQUIRED: 대물렌즈와 카메라 사이의 광 경로에 배치되며, 기록 전극이 있는 손잡이에 정확하게 도달하기 위해 화면의 이미지를 확대할 수 있습니다
사진기	올림푸스	DP72	좋은 카메라는 형광뿐만 아니라 명시야에서도 뉴런을 보는 데 필요합니다. 제어 소프트웨어는 간단하며 사진을 찍고 세포에 대한 전극의 접근을 모니터링하기 위해 라이브 카메라 이미지를 수행 할 수 있습니다. 초고감도 카메라가 필요하지 않습니다.
필터	올림푸스/크로마		생쥐에서 이용된 형광 단백질에 따라서; GFP를 위한 보기: 흥분: BP460-490: 방출: HQ530/50m
전극/시스템 기록
증폭기	헤카	EPC10 USB	기록 전극을 통해 흐르는 전류를 모니터링하고 TTL 신호를 스프리처로 보내 퍼핑을 제어합니다. EPC10 설정은 입니다. 컴퓨터에 의해 제어됩니다.
소프트웨어	헤카	패치마스터	실험 중 증폭기를 제어합니다.
마이크로 매니퓰레이터	셔터	MP225	정밀 micromanipulator, 마이크로미터의 1/10까지 정확한 움직임을 허용합니다; 이 모델은 매우 안정적입니다; 드리프트할 수 있는 유압 매니퓰레이터를 피하십시오
전극 풀러	셔터	P97	FT345-B 폭의 트로프 필라멘트로; 셀에 도달하기 위해 긴 팁으로 약 2μm 직경의 기록 피펫을 준비하기 위해; 저항은 천공 패치 클램프 솔루션으로 15-20Mohm이어야합니다
잔	셔터	BF120-69-10	우리의 기록 조건에서 이 유리는 피펫을 기록하는 데 이상적입니다.
레코딩 챔버	워너 인스트루먼트	RC-26G	현미경으로 준비물을 설정하려면 챔버가 필요합니다. 챔버 중앙에서 준비를 유지하려면 그물/앵커를 사용해야 합니다.
자극
잔	WPI (영어)	TW100F-4	7개 그룹으로 부착된 이 피펫은 미리 당겨진 자극 피펫을 준비하는 데 사용됩니다
Multibarrel 풀러	MDI	PMP-107-Z	당김과 비틀기의 연관에 의해이 풀러를 사용하면 7 개의 배럴로 퍼핑 전극을 준비 할 수
정밀 압력 인젝터	투히컴퍼니	P/N T25-1-900 단일 채널	이 정밀 압력 인젝터는 멀티 배럴 풀러에서 분출되는 압력을 제어하며, 수동 또는 5V TTL에 의해 증폭기에 의해 제어됩니다
마이크로 매니퓰레이터	나리시게	YOU-1 (너-1	거친 매니퓰레이터는 퍼핑 전극을 기록 부위에 가깝게 가져오기에 충분합니다
튜빙
솔루션/관류/화학 물질
진공 펌프	gardner 덴버
관류 시스템	해당 사항 없음	해당 사항 없음
니스타틴	시그마-알드리치	N3503	Perpare Patch Clamp를 위한 Perpare 내부 솔루션 필수
디메틸 설폭사이드	시그마-알드리치	D5879	천공된 패치를 위한 내부 용액을 위해 니스타틴을 용해하는 데 사용됩니다
소금	시그마-알드리치	S9625	세포외 솔루션
염화칼륨	시그마-알드리치	P4504	intracellular/extracellular 용액
염화칼슘 이수화물	시그마-알드리치	C7902	세포외 솔루션
인산나트륨 일염기성 일수화물 (NaH2PO4 )	시그마-알드리치	S9638	세포외 솔루션
황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 (MgSO4 7H2O)	시그마-알드리치	63140	세포외 솔루션
포도당	시그마-알드리치	G8270	세포외 솔루션
중탄산나트륨	시그마-알드리치	S6297	세포외 솔루션
EGTA (에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N ', N'- 테트라 아세트산)	시그마-알드리치	E3889	내부 솔루션
수산화칼륨	시그마-알드리치	P1767	내부 솔루션
메틸 설폭 사이드	시그마-알드리치	W387509	세포내 솔루션
헵스나	시그마-알드리치	H7006	세포내 솔루션
자당	시그마-알드리치	S0389	세포내 솔루션

. 시리즈 . . (단) 시리즈 있습니다 ) . 년 (영문)