Fiber Photometry를 사용하여 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 활동 기록

초록

출처: Martianova, E., et al. 자유롭게 움직이는 동물의 신경 활동을 기록하는 다중 섬유 측광. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 섬유 측광법을 사용하여 자유롭게 움직이는 마우스의 신경 활동을 기록하는 방법을 보여줍니다. 이 방법에서는 특정 뇌 영역의 뉴런이 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현합니다. 이 뇌 영역에 자극이 가해지고 자극에 따른 형광 변화를 측정하여 신경 활동을 식별합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라와 개별 또는 분기 패치 코드 사이의 광학 경로 정렬

1. 5축 변환기의 모든 나사를 풉니다(그림 1B).
2. 1축 변환기에 부착된 어댑터[SMA(초소형 A) 또는 FC(광섬유 커넥터)]에 패치 코드(그림 5B)를 나사로 고정합니다.
3. 저전력(100μW)에서 470nm 여기광(그림 1B)을 켜고 자동 형광 플라스틱 슬라이드를 가리키는 패치코드 끝을 놓습니다. 이것은 향후 녹음과 관련이 없으며 정렬 프로세스를 시각화하기 위한 것입니다.
4. 라이브 모드에서 CMOS 카메라(그림 1B)에서 녹화합니다. 이미지가 완전히 검게 변하지 않을 때까지 게인을 높이거나 룩업 테이블(LUT)을 조정합니다. 요점은 대물렌즈의 초점에서 이미지를 볼 수 있는 것입니다(그림 1B).
5. 5축 변환기를 대물렌즈 쪽으로 전진시켜 카메라에서 이미지를 해결할 수 있을 때까지 470nm 광이 패치 코드의 SMA 또는 FC 끝에 있는 광섬유의 중앙에 있도록 합니다.
6. 이미지가 중앙에 배치되고 잘 해결될 때까지 X축과 Y축을 조정합니다.
7. 패치 코드의 페룰 끝에서 방출되는 빛을 시각화합니다. 등방성 원으로 나타나야 합니다. 분기 패치 코드를 사용하는 경우 각 패치 코드의 페룰 끝에서 방출되는 빛의 양은 비슷해야 합니다. 원이 등방성이 아니거나 방출된 라이트가 같지 않으면 X-Y축에서 5축 변환기를 조정합니다.

2. 평균 형광 강도 측정을 위한 섬유 주변의 ROI 설정

1. 섬유를 더 잘 시각화하기 위해 모든 여기 조명을 켭니다. 픽셀이 포화되지 않고 파이버의 선명한 이미지가 나타나도록 카메라 게인을 조정합니다.
2. 라이브 녹화 또는 예비 이미지 촬영.
3. 파이버 주위에 ROI를 그리고 기록 중 평균 강도 값을 측정하기 위해 보관합니다(그림 1A).
4. 다중 광섬유 녹음의 경우 신호의 독립성을 테스트합니다.
   1. 모든 섬유의 라이브 녹음.
   2. 하나의 광섬유를 광원 쪽으로 향하게 하고 손가락으로 두드립니다. 큰 변동은 해당 채널에서만 발생해야 합니다(허용 가능한 누출 1:1000).
   3. 신호가 독립적이지 않은 경우 더 보수적인 ROI를 다시 그리고 독립성 테스트를 반복합니다.
5. 어떤 ROI가 어떤 섬유, 컬러 테이프 또는 매니큐어가 섬유 끝에 적용될 수 있는지에 해당하는 레이블을 지정하고 추적합니다. 실험을 시작하기 전에 보조 알림으로 사진을 찍습니다.

3. 녹음 경기장 설정

1. 스탠드를 사용하여 경기장 위에 패치 코드를 걸고amps 또는 홀더.
2. 동물이 섬유의 길이에 방해받지 않고 전체 경기장에서 자유롭게 이동할 수 있는지 확인하십시오.
3. 작동 상자나 열린 필드를 사용하는 경우 패치 코드가 최소한의 구부림으로 동물에 도달할 수 있는지 확인하십시오. 노즈 찌르기가 필요한 경우 섬유가 구부러지는 것을 방지할 수 있는 충분한 공간이 머리 위에 있는지 확인하십시오. 패치 코드를 과도하게 구부리거나 꼬지 마십시오.

4. 생체 내 녹음

1. 패치 코드 섬유의 말단 끝을 눈과 미니 화이버 현미경으로 육안으로 검사합니다. 섬유 표면이 긁힌 경우 미세한 입자(1μm 및 0.3μm)가 있는 섬유 연마/래핑 필름을 사용하여 섬유를 다시 연마합니다.
2. 패치 코드의 말단 끝을 70% 에탄올과 면 팁 어플리케이터로 청소합니다.
3. 70% 에탄올과 면 팁 어플리케이터를 사용하여 광섬유 캐뉼라를 청소합니다.
4. 검은색 수축 튜브로 덮인 세라믹 분할 슬리브를 사용하여 패치 코드의 페룰 끝을 이식된 섬유에 연결합니다. 연결하는 동안 슬리브가 단단히 조여졌는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 새 슬리브를 사용하십시오.
   메모: 패치 코드 페룰과 임플란트 사이에 공간이 있으면 많은 양의 신호 손실이 발생하고 녹음이 작동하지 않습니다.
5. 행동 테스트를 시작하기 전에 동물이 몇 분 동안 회복할 수 있도록 합니다.
6. 광 신호 기록을 시작하고 실험을 실행합니다.
7. 녹음하는 동안 고품질 녹음을 보장하기 위해 라이브 추적을 주의 깊게 주시하십시오. 신호는 녹음의 처음 2분 동안 시간의 함수로 급격히 감소할 것으로 예상됩니다. 이 효과는 열 매개 LED 감쇠로 인해 발생하며, 이로 인해 열이 증가하면 광학 소자의 저항이 증가합니다.
8. GCaMP의 on/off kinetics를 초과하는 신호의 점프가 발생하는 경우, 이는 종종 슬리브가 충분히 조여지지 않았고 패치 코드와 임플란트 사이의 공간이 변하고 있음을 나타냅니다. 이 경우 실험을 중지하고 새 슬리브를 사용하여 동물을 다시 연결하십시오.

결과

그림 1: 광섬유 측광 회로도. (A) 두 개의 LED(410nm 및 470nm)의 여기광은 일련의 필터와 다이크로익 미러를 통과하여 20x 대물렌즈의 작동 거리에서 여기 지점을 생성합니다. 빛은 이식된 캐뉼라에 연결된 단일 패치 코드 또는 번들 섬유(다중 사이트 기록용)를 통과합니다. 방출된 형광은 동일한 섬유에 의해 수집되고 필터링되어 CMOS 카메라 센서에 투사됩니다. 캡처된 이미지에서 평균 형광 강도는 각 광섬유의 ROI에 기록됩니다. 410nm 및 470nm LED에서 신호를 동시에 수집하기 위해 시분할 다중화가 구현됩니다(오른쪽 아래 다이어그램). (B) 맞춤형 측광 시스템 및 그 구성 요소의 이미지: (1) 465nm LED에 대한 광섬유, (2) 405nm LED에 대한 광섬유, (3) 콜리메이터, (4)...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 1" 길이	쏘랩스	SH25S100
1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 1/2" 길이	쏘랩스	SH25S050
1/4"-20 스테인리스 스틸 캡 나사, 3/8" 길이	쏘랩스	SH25S038
1000 μm, 0.50 NA, SMA-SMA 섬유 헝겊 조각 케이블	쏘랩스	M59L01
12.7mm 광학 포스트	쏘랩스	TR30/남
12.7mm 받침대 포스트 홀더	쏘랩스	PH20EM
15V, 2.4A 전원 공급 장치( 포함) T-Cube용 3.5mm 잭 커넥터	쏘랩스	KPS101
20x 대물렌즈	쏘랩스	RMS20배
30mm 케이지 큐브(다이크로익 필터 마운트	쏘랩스	CM1-DCH/남
405nm LED	Doric 렌즈	CLED_405
410nm 대역 통과 필터	쏘랩스	FB410-10
465 nm의 발광 다이오드	Doric 렌즈	CLED_465
470nm 대역통과 필터	쏘랩스	FB470-10
560nm 대역통과 필터	셈록	FF01-560/14-25
560nm LED	Doric 렌즈	CLED_560
5축 키네마틱 마운트	쏘랩스	K5X1
무채색 Doublet	쏘랩스	AC254-035-A-ML
405 콜리메이터용 어댑터	쏘랩스	서기11F
조정 가능한 콜리메이터용 어댑터	쏘랩스	서기 127-F
알루미늄 브레드보드	쏘랩스	MB1824
클램핑 포크	쏘랩스	CF125
큐브 커넥터	쏘랩스	CM1-CC
듀얼 493/574 다이크로익	셈록	FF493/574-DI01-25X36
GCaMP6용 방출 필터	셈록	FF01-535/22-25
블랙 하드보드 패널이 있는 인클로저	쏘랩스	XE25C9
가공을 위한 외부 SM1 나사산 엔드 캡	쏘랩스	SM1CP2M
빠른 변경 SM1 렌즈 튜브 필터 홀더	쏘랩스	SM1QP
405nm 광을 위한 고정 콜리메이터	쏘랩스	F671SMA-405
470 및 560nm 광을 위한 고정 콜리메이터	쏘랩스	F240SMA-532
친환경 배출 필터	셈록	FF01-520/35-25	라이트 빔 스플리터에서
고해상도 USB 3.0 CMOS 카메라	쏘랩스	DCC3260M
광선 스플리터	신경광도측정학	쪼개다
Longpass Dichroic Mirror, 425 nm 컷오프	쏘랩스	DMLP425R
Longpass Dichroic Mirror, 495 nm 컷오프	셈록	FF495-Di03
메타본드 치과용 시멘트	C&B
M8 - M8 케이블	Doric 렌즈	Cable_M8-M8
광섬유 캐뉼러	Doric 렌즈		낮은 자가형광이 필요한 측광 실험에 사용된다는 것을 지정해야 합니다.
광섬유 Patchcord	Doric 렌즈		낮은 자가형광이 필요한 측광 실험에 사용된다는 것을 지정해야 합니다.
적색 방출 필터	셈록	FF01-600/37-25	라이트 빔 스플리터에서
T7 랩잭	랩잭
T-cube LED 구동기	쏘랩스	LED1B
USB 3.0 I/O 케이블, Hirose 25, DCC3240용	쏘랩스	택시-DCU-T3

시리즈 시리즈 포함) (영문) 년 시리즈