쥐 뇌 절편에서 Retinogeniculate 및 Corticogeniculate 시냅스에 대한 전기생리학적 연구

초록

출처: Chen, X., et al. 레티노겐화 및 피질유발 시냅스 기능에 대한 전기생리학적 조사. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 쥐의 뇌 절편에서 망막 생성 및 피질 생성 시냅스의 전기 생리학적 기록을 설명합니다. dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN)를 포함하는 절편은 기록 챔버에 배치됩니다. 자극 피펫은 망막 신경절 세포(RGC)를 자극하고 망막 자극 시냅스를 조사하기 위해 시신경관에 배치되거나 피질 뉴런을 자극하고 피질 생성 시냅스를 조사하기 위해 망상 시상핵(nucleus reticularis thalami)에 배치됩니다. 자극을 받으면 망막 신경세포와 피질 뉴런은 흥분성 신경전달물질을 방출하여 LGN 중계 뉴런에서 시냅스 전류를 생성합니다. 이러한 전류는 패치 클램프 기록 피펫을 사용하여 기록됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 솔루션

1. 해부 솔루션
   1. 흥분 독성을 줄이려면, 여기에 제시된 대로 해부 중에 사용할 콜린 기반 용액을 준비하십시오 (mM): 87 NaCl, 2.5 KCl, 37.5 염화콜린, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 CaCl₂, 7 MgCl₂, 및 25 포도당. 실험 1주일 전에 해부 용액을 준비합니다.
2. 녹음 솔루션
   1. 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂ 및 25 포도당을 포함하는 (mM) 인공 뇌척수액(ACSF) 용액을 준비합니다. 50μM D-2-Amino-5-phosphonovaleric acid(D-APV) 및 10μM SR 95531 hydrobromide(gabazine)를 추가하여 N-methyl-D-aspartate(NMDA) 및 GABAA 수용체를 각각 차단합니다.
3. Intracellular 솔루션
   1. 다음을 포함하는 세포 내 용액을 준비합니다 (mM) : 35 Cs-글루코네이트, 100 CsCl, 10 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 10 에틸렌 글리콜 테트라아세트산(EGTA) 및 0.1 D-600(메톡시베라파밀 하이드로클로라이드). CsOH를 가진 7.3에 PH를 조정하십시오. 원액을 여과하고 분취하여 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.

2. 해부

1. 두 개의 슬라이스 챔버를 준비하며, 그 중 하나는 100mL의 해부 용액으로 채워지고 다른 하나는 100mL의 기록 용액으로 채워집니다. 두 개의 비커를 수조(37°C)에 넣고 해부 전에 최소 15분 동안 탄수화물로 용액에 거품을 냅니다.
2. 플라스틱 비커에 거의 얼음처럼 차가운(얼지 않은) 해부 용액 250mL를 채웁니다. 사용하기 최소 15분 전에 탄수화물로 거품을 일으키십시오.
3. 뇌 해부가 수행되는 플라스틱 페트리 접시(100mm x 20mm)에 냉간 해부 용액을 채웁니다. 여과지 한 장을 페트리 접시 뚜껑에 넣습니다.
4. 비브라톰의 해부실을 식힙니다.
5. 예를 들어, 마우스 케이지에서 2.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 쥐가 꼬리 꼬집기에 반응하지 않으면 경추 수질 근처에서 쥐의 목을 베고 페트리 접시 바닥의 얼음처럼 차가운 해부 용액에 머리를 담그십시오.
6. 머리의 피부를 꼬리에서 코까지 자르고 손가락으로 옆으로 유지하여 두개골을 드러냅니다. 전뇌를 적출하려면 먼저 후방-전방 정중선과 함께 두개골을 절단한 다음 관상 봉합사와 양측 봉합사를 통해 두 번 더 절단합니다(그림 1A).
7. 대뇌가 노출되도록 관상동맥 봉합사와 양봉합사 사이의 두개골을 제거합니다. 후각구를 절단하고 미세한 칼날로 전뇌와 중뇌를 분리합니다(그림 1B). 얇은 주걱으로 두개골에서 뇌를 제거하고 페트리 접시 뚜껑의 여과지에 올려 놓습니다.
   메모: 2.6단계와 2.7단계는 세포 사멸을 줄이기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
8. 뇌 절편에서 dLGN에 대한 감각 및 피질 입력의 무결성을 보존하려면 3-5° 각도의 시상 절단으로 두 반구를 분리합니다(그림 1C, D). 두 반구의 중간 평면을 여과지에 올려 건조시킨 다음 수평면에서 10-25° 각도로 절단 스테이지에 붙입니다(그림 1E).
9. 스테이지를 금속 버퍼 트레이 중앙에 놓고 나머지 얼음처럼 차가운 해부 용액을 버퍼 트레이에 부드럽게 붓습니다. 강한 붓기는 붙여넣은 뇌를 제거할 수 있으므로 이 단계를 주의해서 수행합니다(그림 1F).
10. 완충 트레이를 얼음이 채워진 트레이에 넣으면 해부하는 동안 낮은 온도를 유지하는 데 도움이 됩니다. 면도날로 0.1mm/s의 속도와 1mm의 진폭으로 250μm 슬라이스를 자릅니다.
11. 산소가 함유된 박리 용액으로 채워진 보관 챔버에 슬라이스를 34°C에서 약 30분 동안 보관한 다음 34°C의 기록 용액에서 슬라이스가 다시 30분 동안 회복되도록 합니다.
12. 회수 후 수조에서 슬라이스 고정 챔버를 제거하고 실험에 사용할 때까지 슬라이스를 실온(RT)에 보관하십시오.

3. 전기생리학

1. 붕규산 유리 모세관과 필라멘트 풀러를 사용하여 피펫을 당깁니다. 기록 피펫의 저항을 3−4 MΩ으로 유지하십시오. 동일한 프로토콜을 사용하여 자극 피펫을 당기되 당긴 후 팁을 약간 부러뜨려 직경을 늘립니다. 기록 피펫에는 세포 내 용액과 biocytin을 채우고, 자극 피펫에는 기록 용액을 채웁니다.
2. 슬라이스를 기록 챔버에 넣고 RT에서 산소가 공급된 기록 용액으로 슬라이스를 지속적으로 관류합니다. 모든 슬라이스를 확인하고 온전한 시관을 표시하는 슬라이스를 선택합니다.
3. 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC) 비디오 현미경이 장착된 정립 현미경으로 절편과 세포를 시각화합니다.
   메모: 릴레이 뉴런(relay neuron)은 더 큰 소마(soma) 크기와 더 많은 1차 수상돌기(soma)에 의해 인터뉴런(interneuron)과 구별됩니다. 인터뉴런(interneuron)은 더 작은 소마(soma)를 가진 양극성 형태(bipolar morphology)를 나타냅니다.
4. 기록 피펫으로 세포를 패치하기 전에 자극 피펫을 슬라이스에 놓습니다. 망막 신경절 시냅스를 조사하기 위해, 자극 피펫을 망막 신경절 세포의 축삭 섬유가 묶여 있는 시신경관에 직접 놓습니다(그림 2A). 피질형성 시냅스를 분석하기 위해, dLGN에 배측으로 인접한 시상핵(nucleus reticularis thalami)에 자극 전극을 놓습니다(그림 2B).
5. 기록 피펫이 기록 용액에 담기면 5mV 전압 단계를 적용하여 피펫 저항을 모니터링합니다. 유지 전위를 0mV로 설정하고 유지 전류가 0pA가 되도록 오프셋 전위를 취소합니다.
6. 양압을 가하는 동안 기록 피펫으로 세포에 접근합니다. 피펫이 세포막에 직접 접촉하면 양압을 해제하고 유지 전위를 -70mV로 설정합니다. 세포막이 유리 피펫에 부착되어 기가옴 밀봉이 형성되도록 약간의 음압을 가합니다(저항 >1 GΩ). 피펫 커패시턴스를 보상하고 음압 펄스를 적용하여 셀을 엽니다.
7. 시냅스 기능을 조사하려면 자극 피펫을 통해 0.1ms 전류 펄스(약 30μA)를 적용합니다. 시냅스 반응이 관찰되지 않으면 자극 피펫을 교체해야 할 수 있습니다. 기록된 세포가 손실되지 않도록 자극 피펫을 다른 위치에 배치하는 동안 주의하십시오.
   메모: 그림 2에 표시된 예시 기록에서, 시냅스 단기 가소성은 30ms 자극 간 간격으로 시신경 또는 피질 형성 섬유를 두 번 자극하여 조사되었습니다. 쌍펄스 비율(PPR)은 두 번째 여자 시냅스 후 전류(EPSC)의 진폭을 첫 번째 EPSC(EPSC2/EPSC1)의 진폭으로 나누어 계산했습니다. 각 자극 프로토콜은 20회 반복되었습니다. EPSC 진폭은 20 스윕의 평균 전류에서 측정되었습니다. 각 반복 사이의 시간 간격은 반복에 의해 유도된 단기 가소성을 피하기 위해 최소 5초였습니다.
8. 5mV 전압 단계를 적용하여 직렬 저항을 지속적으로 모니터링합니다. 직렬 저항이 20MΩ보다 작은 셀만 분석에 사용하십시오.

결과

그림 1 : 해부 프로토콜을 나타내는 체계입니다. (A) 초기 절단의 위치를 보여주는 마우스 두개골의 수평 보기. 첫 번째 절단은 시상 봉합사와 함께 수행되었으며, 이어서 관상 봉합사 및 양봉선 봉합사와 함께 또 다른 두 개의 절단이 수행되었습니다. 파선은 절개 부위를 나타냅니다. (B) 전체 뇌의 시상면보기. 점선은 대뇌가 후각구와 중뇌로부터 분리되어 있음을 나타냅니다. (C-D) 이 패널은 각각 수평(C) 및 코로나(D) 보기에서 두 반구를 분리하는 첫 번째 절단 각도를 보여줍니다. (E) 절단 단계에서 한쪽 반구의 코로나 관측. 파선은 슬라이싱 방향을 나타냅니다. l, m, d 및 v는 패널 D...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
증폭기	HEKA 일렉트로닉	EPC 10 USB 더블 패치 클램프 앰프
염화나트륨2	엠슈어	1.02382.1000
염화콜린	시그마-알드리치	C1879-1KG
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	라이카 마이크로시스템즈	TCS SP5
증권 시세	엠슈어	1.02038.0100
Cs-글루코네이트	자체 준비		시판되는 Cs-글루코네이트가 없었기 때문에 저희가 직접 준비했습니다
디-600	시그마-알드리치	M5644-50MG
D-APV	바이오트렌드	BN0085-100
현미경 O용 디지털 카메라	올림푸스	XM10
에그타	세르바	11290.02
포도당	시그마-알드리치	49159-1KG
헤페스	로스	9105.2
고전류 자극 아이솔레이터	세계적인 정밀 기기	A385
케이클	엠슈어	1.04936.1000
마그네슘Cl2	엠슈어	1.05833.0250
마이크로 매니퓰레이터	루이그스 & 노이만	SM7
미로스코프	올림푸스	BX51
장착 매체	써모피셔 사이언티픽	P36930
염화나트륨	로스	3957.1
나H2PO4	엠슈어	1.06346.1000
나HCO3	엠슈어	1.06329.1000
피펫	힐겐베르크	1807502
끌어당기는 사람	셔터	P-1000
면도날	페르소나	우편번호 60-0138
반자동 진동	라이카 바이오시스템즈	VT1200S
SR 95531 브롬화수소화물	바이오트렌드	AOB5680-10	GABAA-수용체 길항제