쥐의 뇌에 무선 양방향 미세전극 시스템 이식

초록

출처: Melo-Thomas, L., et al., 자유롭게 행동하는 쥐의 신경 활동 생체 내 기록 및 자극을 위한 무선 양방향 인터페이스. J. Vis. 특급 (2017년)

이 비디오는 무선 양방향 다채널 전극 장치를 쥐의 뇌에 이식하여 다채널 신경망을 기록하고 자극하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 동물

1. 수컷 성인 Wistar 쥐 (200-250g)를 3-4 마리의 그룹으로 수용하여 수술 전 최소 1 주일 동안 순응을 가능하게합니다.
2. 수술 이틀 후, 집쥐는 짝을 지어 기르게 됩니다. 높은 아크릴 뚜껑으로 단일 케이지를 덮으십시오. 금속 그리드로 만든 기존 뚜껑은 임플란트가 끼어 시간이 지남에 따라 손상되거나 불안정해질 위험이 높아질 수 있으므로 피하십시오.

2. 정위 수술

1. 수술을 시작하기 전에 다음 장비와 재료를 정리하고 준비하십시오.
   1. 멸균 가위, 뭉툭한 집게, 주걱, 수술용 이발기, 치과 드릴 및 면봉으로 구성된 멸균 수술 장비를 구하십시오.
   2. 이소플루란, 자일로카인, 트라마돌 염산염, 덱스판테놀 안연고, 3% 과산화수소, 포비돈 요오드 및 70% 에탄올을 포함한 약물 및 화학 물질을 얻습니다.
   3. 스테인리스 스틸 나사, 아크릴 수지, 자외선 접착제 및 캡 프로텍터를 포함한 고정 재료를 구하십시오.
   4. (i) 기록 단일 전극(석영 유리 절연 백금 텅스텐 미세 전극, 원뿔형 팁 모양, 외경: 80μm, 원추형 팁, 1kHz에서 임피던스: 500kOhm) 또는 사극(석영 유리 절연 백금/텅스텐 4코어 미세 전극, 외경: 100μm, 원추형 팁, 1kHz에서 임피던스)으로 구성된 미세 전극 장치를 얻습니다. 500-800 kOhm); (ii) 접촉판에 연결된 자극 전극(백금/이리듐 와이어(90% 백금, 10% 이리듐), 코어 직경 125μm, 외경 150μm, 임피던스<10kOhm) 및 (iii) 백금 와이어 기준 전극(샤프트 직경, 100μm; 그림 1A).
   5. 미세 전극 장치에 수용성 접착제로 접착된 전극 홀더를 구하고 최소 2시간 전에 기능을 테스트합니다(그림 1B).
   6. 녹음을 위한 차동 프리앰프, 메인 앰프 및 대역통과 필터 앰프로 구성된 기존의 테더 시스템을 얻을 수 있습니다.
   7. 장갑, 발열 패드, 주사기 및 생리식염수와 같은 추가 재료를 구합니다.
   8. 가정용 케이지(L x W x H: 42cm x 26cm x 38cm)를 구합니다.
2. 절차
   참고: 전극 삽입은 이소플루란 마취 하에 기존의 정위 수술 중에 수행됩니다.
   1. 실험자가 장갑, 수술용 마스크 및 실험복을 착용하고 있는지 확인합니다.
   2. 동물을 유도실(이소플루란 4-5%, 산소 유량 1L/분, 지속 시간 ~5분)에 동물을 배치하여 마취를 시작합니다.
   3. 깊은 마취를 확인하기 위해 집게로 반사 상실(꼬리 및 발가락 반사)을 테스트합니다.
   4. 정위 골격의 위쪽 앞니 막대 주위에 고정된 마취 마스크에 동물의 머리를 놓고 마취를 조정합니다(이소플루란 2-3%, 산소 유량 0.7-0.8L/min).
   5. 이어바와 상악 앞니를 사용하여 정위 장치에 동물의 머리를 고정하고 수평으로 정렬합니다.
   6. 수술용 이발기나 가위를 사용하여 수술 부위를 면도하고 포비돈 요오드로 살균합니다.
   7. 저체온증을 예방하기 위해 동물을 발열 패드에 올려 놓고 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 덱스판테놀 안약으로 눈을 치료합니다.
   8. 자일로카인(0.3-0.4mL, 피하주사, s.c.)을 수술 부위 중앙에 주사합니다.
   9. 반사 신경 상실을 다시 테스트하십시오.
   10. 수술 부위 중앙에 메스로 작은 절개 (1.5cm)를 만들어 두개골을 노출시킵니다. 피부를 부드럽게 분리하고 집게, 가위, 주걱을 사용하여 잔여 조직을 제거합니다.
   11. 과산화수소로 코팅된 면봉을 사용하여 두개골을 조심스럽게 청소합니다.
   12. 스테인리스 스틸 나사를 고정하기 위해 두개골에 4-5개의 작은 구멍(4.7mm)을 뚫습니다.
   13. 미세 전극 장치/전극 홀더를 프리에 연결합니다.ampliifier를 선택하고 정위 미세 조작기에 부착합니다(그림 1B 및 1C).
   14. 사용된 동물에 따라 뇌 지도의 좌표를 사용하여 목표 영역 위의 두개골에 구멍(약 7mm)을 뚫습니다. 본 연구에서는 다음 좌표를 사용하여 하구를 겨냥한 전극 팁을 배치하고 브레그마를 기준으로 합니다: 전방/후방, -8.8mm; 내측/측방, 1.5mm; 및 등쪽 / 복부, 3.5mm.
   15. 면봉으로 모든 혈액을 흡수하십시오.
   16. 전극 팁이 목표 영역에 도달할 때까지 미세 전극 장치를 수직으로 삽입합니다.
   17. 접지 케이블을 스테인리스 스틸 나사를 따라 피부 아래에 배치합니다.
   18. 스파이크 활동을 모니터링하고 표적 구조의 활성 뉴런 영역에 도달할 때까지 마이크로 매니퓰레이터로 전극 위치를 신중하게 조정하고 스파이크 분류에 적합한 신호 대 잡음비로 신경 활동을 감지합니다.
   19. 미세 전극 장치를 자외선 접착제로 두개골에 고정하고 접촉판과 나사를 아크릴 수지로 덮습니다.
   20. 생리식염수(1mL i.p.)와 트라마돌(25mg/kg, s.c.)을 각각 주사하여 탈수를 예방하고 수술 후 진통제를 보장합니다.
   21. 물에 적신 브러시를 사용하여 전극 홀더에서 미세 전극 장치를 분리합니다.
   22. 마취를 중지하고 정위 프레임에서 쥐를 조심스럽게 제거합니다. 프리앰프를 미세 전극 장치에서 분리합니다.
   23. 이식된 미세 전극 장치의 캡 보호 장치를 연결하고 실험 절차 중에만 분리하십시오.

결과

그림 1 : TWS 미세 전극 장치. (1) 단일 전극/사극 기록, (2) 자극 전극, (3) 전극 광섬유 연결 보드, (4) 유연한 연결 케이블, (5) 접지선, (6) 커넥터 보드, (7) TWS 시스템용 수형 또는 암형 커넥터(A); 상기 프리앰프(8) 및 홀더(9)에 연결된 TWS 미세전극부; (B) 입체성 프레임(C)에 부착할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
THOM Wireless System(TWS) 버전 2.0	토마스 레코딩 GmbH	AN001165	TWS(Thomas Wireless System) 버전 2.0은 랩톱 컴퓨터, 사전 설치된 Microsoft Windows 운영 체제 및 TWS 제어 소프트웨어가 있는 휴대용 다중 채널 원격 측정 시스템입니다. TWS에는 고정 대역폭의 저소음 4채널 사전 및 프로그래밍 가능한 메인 증폭기, 이중 위상 전류 펄스 적용을 위한 단일 채널 정전류 자극기, 소프트웨어 프로그래밍 가능한 마이크로 자극기, 이식 가능한 커넥터 시스템 및 동물에 장착하기 위한 기본 헤드 스테이지 장치가 포함됩니다. 이 시스템은 랩톱 또는 데스크톱 개인용 컴퓨터용 USB 포트 연결이 있는 트랜시버와 함께 제공되며, 제어 소프트웨어는 Microsoft 운영 체제 Windows에서 실행됩니다. TWS 시스템은 자유롭게 행동하는 작은 동물(예: 쥐, 기니피그)의 세포 외 신경 자극 및 기록에 사용할 수 있습니다. 이 시스템은 더 큰 동물(예: 영장류)에도 사용하도록 조정할 수 있습니다.
THOM Wireless System(TWS)용 소프트웨어	토마스 레코딩 GmbH	AN001165에 포함	Thomas 무선 시스템용 소프트웨어는 Microsoft Windows 운영 체제에서 실행되며 Thomas 무선 시스템(TWS)용 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 제공합니다. TWS GUI는 TWS 기능(4채널 녹음 및 1채널 시뮬레이션)을 완벽하게 제어할 수 있습니다.
녹음(4채널) 및 자극(단일 채널)을 위한 이식형 사극	토마스 레코딩 GmbH	AN001132	Thomas Wireless Systems(TWS)와 함께 사용하기 위한 녹음(4채널) 및 자극(단일 채널)을 위한 이식형 사극 기록 사극 사양 : 사극 섬유 재료 : 석영 유리 절연 백금 텅스텐 섬유, 사극 섬유 외경 : 100μm, 팁 모양 D, 임피던스 0.5-0.8MOHm; 기준 전극 : 팁 모양 : D; 임피던스 : 300-500kOhm; 재질 : 석영 유리 절연 백금 / 텅스텐; 자극 전극 사양: 섬유 재질: 백금/이리듐, 직경: 125μm, 래커 절연, 팁 모양: D, 임피던스: < 10kOhm, 전극의 치수는 최종 사용자가 지정할 수 있습니다.
기록(단일 채널) 및 자극(단일 채널)을 위한 이식형 미세 전극	토마스 레코딩 GmbH	AN001118	Thomas Wireless Systems(TWS)와 함께 사용하기 위한 기록(단일 채널) 및 자극(단일 채널)을 위한 이식형 미세 전극. 기록 전극 사양 : 전극 섬유 재료 : 석영 유리 절연 백금 텅스텐 섬유, 전극 섬유 외경 : 80μm / 250μm (구체적으로 지정하십시오), 팁 모양 D, 임피던스 0.5-0.8MOHm; 기준 전극 : 팁 모양 : D; 임피던스. 300-500k옴; 재질 : 석영 유리 절연 백금 / 텅스텐; 자극 전극 사양: 섬유 재질: 백금/이리듐, 직경: 125μm, 래커 절연, 팁 모양: D, 임피던스: < 10kOhm
전극 삽입용 홀더	토마스 레코딩 GmbH	AN000838	표준 전극 홀더를 위한 미세 전극 주입을 위한 특수 구부러진 금속 막대. 막대는 이식 가능한 전극을 고정하는 데 사용됩니다. 이식 가능한 전극은 특수 Thomas RECORDING 수용성 접착제(AN001080)로 막대에 고정됩니다. (전극 홀더는 포함되어 있지 않습니다)
Thomas Wireless System용 교체용 축전지 전원 공급 장치(3,7V/230mAh)	토마스 레코딩 GmbH	AN001208	230mA 용량의 Thomas Wireless System용 교체 충전식 배터리(축전지)로 약 1시간 작동 시간. (크기: 27mm x 20mm x 6mm, 무게 약 6g)
Thomas Wireless System용 교체용 축전지 전원 공급 장치(3,7V/450mAh)	토마스 레코딩 GmbH	AN001209	450mA 용량의 Thomas Wireless System용 교체 충전식 배터리(축전지)로 1시간 이상 작동합니다. (크기: 48mm x 30mm x 4mm, 무게 약 11g)
THOMAS Wireless System(TWS) 충전식 축전지용 축전지 충전기	토마스 레코딩 GmbH	AN001207	TWS(Thomas Wirless System) 충전식 축전지(AN001209 및 AN001209)용 주전원 충전기
수용성 접착제	토마스 레코딩 GmbH	AN001080	Thomas RECORDING 수용성 전극 접착제는 신경 과학 연구에서 이식형 미세 전극과 함께 사용하기 위해 특별히 선택된 제품입니다. 그 독특한 특성은 전극과 장착 장치 사이의 견고한 연결을 보장하지만 따뜻한 물로 쉽게 제거할 수 있습니다. Thomas RECORDING 수용성 전극 접착제는 시간이 많이 소요되는 준비 없이 즉시 사용할 수 있습니다. Thomas RECORDING 수용성 전극 접착제는 인간, 동물 또는 환경에 해롭지 않습니다. 수량 : 10 그램 1 상자
미니어처 차동 프리앰프	토마스 레코딩 GmbH	AN000329	미니어처 차동 프리앰프(모델 MDPA-2)는 2채널 차동 입력 프리앰프로, 여기성 조직의 저잡음 녹음을 위해 설계되었습니다. 이는 Thomas Wireless System(TWS)을 사용하여 동물을 자유롭게 움직이기 위한 이식형 미세 전극의 이식과 함께 세포 외 기록을 위한 것입니다. 2채널 미니어처 차동 프리앰프(MDPA-2)는 초기 10배 증폭 단계를 제공하기 위해 이식 가능한 미세 전극에 연결됩니다. 이상적으로 Thomas RECORDING 석영 유리 절연 백금/텅스텐 전극을 사용하여 높은 신호 진폭과 낮은 노이즈 레벨로 최적의 녹음 결과를 얻을 수 있습니다. MDPA-2에는 추가 공통 접지 및 기준 전극 입력이 있습니다.
연결 케이블	토마스 레코딩 GmbH	AN000330	Thomas Miniature 차동 프리를 연결하기 위한 연결 케이블ampliifier(MDPA-2)를 메인에 ampliifier 및 축전지 전원 공급 장치.
미니어처 프리앰프를 위한 충전식 전원 공급 장치	토마스 레코딩 GmbH	AN000328	미니어처 차동 프리앰프(MDPA-2)용 충전식 어큐뮬레이터 전원 공급 장치.
어큐뮬레이터 충전기(미국)	토마스 레코딩 GmbH	AN000167	전원 공급 장치 AN000328용 축전지 충전기(미국 주 전원 콘센트 커넥터)
어큐뮬레이터 충전기(EU)	토마스 레코딩 GmbH	AN000168	전원 공급 장치 AN000328용 축전지 충전기(EU 주 전원 콘센트 커넥터)
차동 프리앰프/메인 앰프/대역통과 필터	토마스 레코딩 GmbH	AN000677	TREC AC 메인 앰프(LabAmp-03)는 신경 생리학적 애플리케이션(예: 미세 전극을 사용한 세포 외 녹음)을 위한 단일 채널 차동 메인 앰프입니다. 이 기기는 소형 차동 프리와 함께 작동하도록 설계되었습니다.ampliifier, 모델 MDPA-2. LabAmp-03의 단일 채널에는 고이득, 저잡음 차동 증폭기 스테이지와 저주파 및 고주파 필터가 포함되어 있습니다. 증폭기에는 SUA(Single Unit Activity) 필터 증폭기와 LFP(Local Field Potential) 필터 증폭기의 두 가지 필터 증폭기가 있으며 둘 다 신호 경로에서 병렬로 연결됩니다. 레코드 모드는 첫 번째 단계에서 두 가지 레벨의 신호 게인(x10, x100)을 제공하고 마지막 증폭기 단계에서 4가지 추가 레벨(x5, x10, x25 및 x50)을 제공합니다. 각 증폭기는 단일 장치 활동(SUA) 500Hz...20kHz 및 국부 전위(LFP) 0,1Hz...140Hz에 대해 서로 다른 대역 통과 특성을 갖습니다. 오디오 모니터와 윈도우 판별기가 장치에 통합되어 있습니다. LabAmp-03에는 확성기가 있는 통합 오디오 모니터가 있습니다. 이 장치는 전기 생리학적 신호의 오디오 재생을 제공합니다. 이 장치는 오디오 증폭기를 작고 견고한 패키지에 결합합니다. 이것은 특히 신경 발화 및 근육 수축을 모니터링하는 데 적합합니다. 오디오 모니터 입력은 SUA-Filter 앰프 출력에 내부적으로 연결됩니다. LabAmp-03은 100-240V AC / 50-60Hz의 주 전원 작동 전압 범위를위한 외부 전원 공급 장치와 함께 제공됩니다.
USB 오실로스코프	토마스 레코딩 GmbH	AN001096	USB PC Oszilloskop, 2 Kanal. 이 2채널 PC 오실로스코프는 노트북에서 모바일로 사용할 수 있으며 제어 캐비닛, 산업 장비 및 작고 가벼우며 강력한 오실로스코프가 필요한 기타 여러 애플리케이션에 영구적으로 설치하는 데 적합합니다. 이 오실로스코프는 메인의 신호 출력에 연결됩니다 ampliifier는 Thomas Wireless System(TWS)용 이식 가능한 미세 전극을 이식하는 동안 기록된 세포 외 활동을 표시하기 위한 것입니다. 사용자는 PC 소프트웨어가 포함된 PC에서 직접 여러 데이터 인터페이스를 통해 측정 데이터를 수집할 수 있습니다.
자극 생성기	멀티채널 시스템	STG3008-FA	STG(Stimulus Generator for Current) 및 전압 구동 자극은 전류 구동 자극, 전압 구동 자극, 제어 및 타이밍의 세 가지 기능을 수행합니다. STG는 2, 4 또는 8개의 독립 출력 채널과 함께 사용할 수 있습니다. 각 출력 채널에 대한 통합 절연 장치를 갖춘 STG는 임의의 파형을 제공할 수 있습니다.
전극용 캡 프로텍터	토마스 레코딩 GmbH	AN001193	Thomas Wireless System용 이식형 전극 장치용 보호 캡
수술 장비			가위, 뭉툭한 집게, 주걱, 수술용 이발기, 치과 드릴 및 면봉
의약품 및 화학 물질			이소플루란, 자일로카인, 트라마돌 하이드로클로라이드(Tramadol-CT, AbZ-Pharma GmbH, Ulm, Germany), 덱스판테놀 안연고(Bepanthen, Bayer AG, Leverkusen, Germany), 3% 과산화수소, 포비돈-요오드(Betaisodona, Mundipharma GmbH, Limburg, Germany) 및 70% 에탄올;
를 포함하는 고정 재료			스테인리스 스틸 나사(BN650 M1.2x5, 4.7mm), 아크릴 수지(Paladur, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Germany), 자외선 접착제(Cyberbond U3300, Cyberbond Europe GmbH, 독일) 및 캡 프로텍터(Thomas Recording GmbH, Giessen, Germany);
추가 자료			장갑, 발열 패드, 주사기 및 생리식염수.
소동물 입체 기기(SASI)	토마스 레코딩 GmbH	AN000287	모델은 연구에 사용된 동물(쥐, 기니피그, 원숭이 등)에 따라 선택해야 합니다
비디오 카메라	에버포커스		EverFocus, 모델: EQ150