방법 논문

Photostimulation and Whole-Cell Patch Clamp Recordings of Neurons in Mouse Hippocampal Slices

2025년 7월 8일

이 논문에서

초록

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출처: Richevaux, L., et al. 마우스 뇌 절편에서 장거리 입력의 광유전학적 자극을 위한 생체 내 뇌내 입위 주사. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 형질주입된 쥐 해마 뇌 절편에서 시냅스 상호 작용 및 신경 반응을 연구하는 프로토콜을 보여줍니다. 여기에는 활동 전위를 트리거하기 위해 장거리 감각 뉴런을 조명하고 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 기록된 뉴런에서 결과로 발생하는 흥분성 시냅스 후 전위를 기록하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 급성 슬라이스 녹음을 위한 솔루션

  1. 전기생리학 실험 전에 순수 탈이온수에 10x 인공 뇌척수액(aCSF) 용액(124mM NaCl, 2.5mM KCl, 26mM NaHCO3, 1mM NaH2PO4 및 11mM D-포도당)의 원액을 준비합니다. CaCl2 및 MgCl2 가 없는 1L 병에 용액을 4°C에서 보관하십시오.
  2. post-hoc 세포 형태학 계시를 위해 135mM K-글루코네이트, 1.2mM KCl, 10mM HEPES, 0.2mM EGTA, 2mM MgCl2, 4mM MgATP, 0.4mM Tris-GTP, 10mM Na2-포스포크레아틴 및 2.7–7.1mM 바이오사이틴을 함유하도록 칼륨-글루코네이트 기반 피펫 용액을 준비합니다. 용액의 pH를 7.3으로, 삼투압을 290mOsm으로 조정합니다. 1mL 부분 표본을 -20°C에서 보관하십시오.

2. 전체 셀 패치 클램프 기록

  1. 맞춤형 유리 전사 피펫을 사용하여 해마 복합체를 포함하는 뇌 절편을 정립 현미경에 장착된 기록 챔버로 부드럽게 옮깁니다. 전사 피펫은 고무 피펫 전구에 부착된 단축된 파스퇴르 피펫(내경 6.5mm)으로 만들어집니다. 95%/5% O2/CO2로 거품이 일어난 34°C(가열) aCSF로 기록 챔버(3mL)를 연속 관류합니다. 연동 펌프의 속도를 2-3mL/분으로 설정합니다.
  2. 청색 LED 조명(470nm)으로 관심 영역의 축삭 말단에서 Chronos-GFP 발현을 간략하게 검사하고 4x 대물렌즈로 관찰합니다. GFP 형광은 적절한 방출 필터를 통해 시각화되며 CCD 카메라 이미지가 컴퓨터 화면에 표시됩니다.
  3. 촘촘한 간격의 나일론 끈("하프")이 있는 U자형 백금 와이어로 만든 슬라이스 앵커를 슬라이스에 놓고 슬라이스를 유지합니다.
  4. 63x 몰입 대물렌즈로 변경하고 초점을 조정합니다. Chronos-GFP를 발현하는 축삭돌기를 확인하고 패치 기록을 위해 피라미드 뉴런을 선택합니다.
  5. 목표를 위쪽으로 이동합니다.
  6. 붕규산 유리의 Brown-Flaming 전극 풀러를 사용하여 피펫을 당깁니다. 풀러는 팁 직경이 약 1μm인 피펫을 생성하도록 설정되어 있습니다. 피펫을 K-글루코네이트 기반 내부 용액으로 채웁니다.
  7. 헤드 stage의 피펫 홀더에 피펫을 장착합니다. 챔버에서 피펫을 내리고 대물렌즈 아래에서 팁을 찾습니다. 피펫 저항은 3–8MΩ 사이여야 합니다. 주사기로 가벼운 양압을 가하여 용액 원뿔이 피펫에서 유출되는 것을 확인하고 피펫과 대물렌즈를 슬라이스 표면으로 점진적으로 내립니다.
  8. 전압 클램프 구성으로 세포를 패치합니다: 식별된 뉴런에 접근하여 피펫 팁을 소마에 섬세하게 누릅니다. 양압은 멤브레인 표면에 딤플을 생성해야 합니다. 압력을 해제하여 기가 옴 밀봉 (>1GΩ 저항)을 생성합니다. 밀봉되면 유지 전압을 -65mV로 설정합니다. 날카로운 음압 펄스로 멤브레인을 파괴하십시오 : 이는 피펫 홀더에 연결된 튜브에 강한 흡입력을 가함으로써 달성됩니다.
  9. 전체 셀 전류 클램프 모드에서 과분극 및 탈분극 전류 단계에 대한 뉴런의 반응을 기록합니다(그림 1A).
    메모: 이 프로토콜은 세포의 능동 및 수동 고유 속성을 결정하는 데 사용됩니다. 사용자 지정 작성된 MATLAB 루틴은 오프라인 분석에 사용됩니다.
  10. 크로노스를 표현하는 구심성 섬유의 전체 필드 475nm LED 자극에 대한 전류 또는 전압 클램프 시냅스 후 반응을 기록합니다. 20Hz에서 2ms 지속 시간의 10회 자극의 트레인으로 자극합니다(그림 1 B, C). 광도는 0.1–2mW.
    까지 다양할 수 있습니다. 메모: 광도는 대물렌즈 아래에 위치한 포토다이오드 센서가 장착된 디지털 휴대용 광 전원 콘솔로 측정되었습니다. 2-4ms의 응답 대기 시간은 단일 시냅스 연결의 특징입니다.

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결과

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그림 1: Presubicular layer III 뉴런: 내재적 특성, 시상 구심성의 빛 자극에 대한 반응 및 세포 형태학의 사후 계시. (A) 과분극 및 탈분극 전류 단계를 위한 레이어 III 뉴런의 발사 패턴 및 막 전위 변화. (나, 다) (B) 전류 클램프 및 (C) 전압 클램프 모드에 기록된 시상 축삭의 2ms 광 자극(파란색 막대)에 대한 레이어 III 뉴런의 반응. (디, 이) 고배율(E, 눈금 막대 = 50μm)에서 공초점 현미경으로 이미지화된 수평 슬라이스에서 DAPI 염색(파란색)과 함께 C...

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
케이클시그마P4504최종 1.2mM
염화마그네슘시그마63069최종 2mM
멀티클램프 700B축삭 기기
pClamp 획득 소프트웨어축삭 기기
연동 펌프길슨미니펄스 314-16 디스플레이에서 2-3 ml/분
글루콘산칼륨(K-글루코네이트)시그마G4500최종 135mM
붕규산 모세 혈관Havard 장치GC150-10외부 직경 1.5mm, 내경 0.86mm
브라운 불타는 전극 끌어당기는 사람셔터 기기P-87
에그타시그마E4368최종 0.2mM
470nm LED케언 리서치P1105/470/LED 직류/59022mGFP용 일치하는 여기 필터 470/40x 및 방출 필터와 함께 사용
AAV5입니다. 싱크로노스-GFP.WPRE.bGH펜 벡터 코어AV-5-PV3446로트 V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13
CCD 카메라안도르DL-604M
컨포칼 현미경자이스LSM71020배
디지데이터 1440A축삭 기기
디지털 핸드 헬드 광학 미터토르랩스미세먼지100D475nm에서 파라미터
헤페스시그마H3375 (영문최종 10mM
LED 전원 공급 장치케언 리서치OptoLED 광원
시리즈 (영문) 시리즈 지정 )

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Chronos GFPLED

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