뇌 절편에 있는 신경 세포의 동시 광학 및 전기 생리학적 모니터링

초록

출처: Murphy, C. A., et al. 뇌 절편에서 구심성 경로의 광유전학적 활성화 및 휘발성 마취제에 의한 반응 조절. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 다중 채널 녹음을 위한 하드웨어 및 소프트웨어 준비

1. 제조업체 지침에 따라 16채널 데이터 수집 시스템을 설정합니다.
   메모: 여러 상용 증폭기 및 데이터 수집 시스템을 사용하여 다중 채널 녹음을 수집할 수 있습니다. 여기에 설명된 실험에서 아날로그 신호는 전극 참조 패널을 통해 두 개의 증폭기로 전달되며, 여기서 증폭(2000x) 및 필터링(0.1-10kHz)됩니다. 데이터 수집 시스템에 대한 아날로그 입력은 40kHz에서 디지털화됩니다.
2. 적절한 16채널 헤드 스테이지 어댑터를 현미경 마이크로 매니퓰레이터에 고정합니다. 암 커넥터 포트가 아래를 향하도록 어댑터의 방향을 지정합니다.
3. 이 마이크로 매니퓰레이터의 작동 각도를 조정하여 수평을 기준으로 약 70° 각도로 녹음 챔버를 향해 아래쪽을 향하도록 합니다.
4. 헤드 연결tage 입력을 통해 체외 전기 생리학을 위한 16 x 1 프로브에 연결합니다.tage 마이크로 매니퓰레이터에 고정된 어댑터.
5. 헤드 스테이지 출력 커넥터를 데이터 수집 시스템에 연결합니다.
6. 데이터 수집에 적합한 소프트웨어를 설치합니다. 처음 15개의 다중 채널 프로브 접점의 입력 신호에 해당하도록 15개의 입력 채널을 구성합니다. 세포 내 전극에서 입력을 수신하도록 나머지 채널을 구성합니다.
   메모: 데이터를 수집하고 분석할 때 전극 및 어댑터 맵을 고려하여 적절한 신호가 수집된 전극 접점과 일치하는지 확인해야 합니다.

2. 광 자극 프로토콜 구성

1. 광 전달 시스템을 설정하고 함께 제공되는 소프트웨어를 설치하십시오.
2. 소프트웨어를 엽니다. 트리거 소스(디지털/TTL(트랜지스터-트랜지스터 로직) 출력)이 광 전달 시스템에 트리거 입력 신호를 제공하고 광 전달 시스템이 470nm LED(발광 다이오드)에 트리거 출력 신호를 제공하는 하드웨어 배선 구성을 선택합니다.
3. 고출력 대물 렌즈를 장착합니다. 디지털 카메라를 사용하여 광 전달 시스템으로 고출력 대물렌즈를 보정합니다.
4. 광 자극 프로파일의 새 프로파일 시퀀스를 만듭니다.
   1. 원하는 패턴을 만듭니다. 여기에 설명된 실험에서 직경 150μm의 원은 축삭 말단의 층별 활성화를 허용합니다.
   2. 프로필 시퀀스를 구성하려면 여러 시도 각각에 대해 이 프로필을 복사하여 붙여넣습니다.
   3. 모든 광도, 펄스 지속 시간 또는 펄스 수의 파형을 포함하는 파형 목록을 만듭니다.
   4. 각 프로파일에 파형을 무작위로 할당합니다. 할당된 파형이 있는 각 프로파일은 디지털 TTL 입력의 트리거 펄스 1개 또는 트라이얼 1개에 해당합니다.
   5. 프로파일 시퀀스를 저장합니다.
5. 데이터 수집 소프트웨어에서 새 프로토콜을 만듭니다.
   1. 시도 수를 생성된 프로필 순서의 프로필 수와 동일하게 설정합니다.
   2. 1.6단계에서 구성한 것과 일치하는 신호 입력을 선택합니다. 단일 디지털 TTL 출력을 제공하는 프로토콜을 구성하고, 디지털 트리거 전후의 적절한 시간 동안 16개의 입력 채널에서 기록합니다.

3. 생체 외 뇌 조직 절편에 다중 채널 프로브 배치

1. 3-6mL/분으로 eACSF(Experimental Artificial Cerebrospinal fluid)(밀봉된 백이 아님)를 관류합니다.
2. 관심 영역이 포함된 뇌 절편을 현미경 관류 챔버의 메쉬 그리드로 옮깁니다. 플래티넘 하프가 있는 앵커
3. 다중 채널 프로브의 말단부에 있는 전극 접촉선이 pial 표면에 거의 수직이 되도록 메쉬 그리드를 회전합니다.
4. 다중 채널 프로브를 광시야 조명과 마이크로 매니퓰레이터의 미세한 제어 아래에서 슬라이스 표면 쪽으로 내립니다.
5. 필터 큐브 터렛을 회전하여 적절한 필터 큐브를 작동시켜 피질 구심성의 축삭 말단에서 발현되는 형광 리포터 단백질을 시각화합니다. 필요한 경우 슬라이스를 회전하여 프로브를 파이얼 표면과 보다 정확하게 정렬합니다.
6. x축을 따라 최종 목표 위치에서 ~200μm 떨어진 슬라이스 평면 바로 위에 프로브를 배치하고, 기록되는 조직 영역의 경계 외부에 하나 이상의 채널을 남겨둡니다.
7. 세로축을 따라 매니퓰레이터를 움직여 프로브를 슬라이스에 천천히 삽입합니다. 조직의 손상을 최소화하려면 날카로운 팁이 조직 표면 바로 아래에서 보일 때까지만 프로브를 전진시키십시오. 이렇게 하면 조직의 손상을 최소화하는 동시에 전극 접점이 조직과 접촉하도록 할 수 있습니다.

4. 표적 뉴런 패치 클램핑 및 전체 세포 구성 획득

1. eACSF 소스를 배깅된 제어 솔루션으로 전환합니다.
2. 표적 패치 클램프 기록을 위해 형광 표지된 세포를 식별합니다.
   1. 조리개 조리개 조리개를 가장 작은 직경으로 제한합니다. 저전력 대물 렌즈를 사용하여 조직에 초점을 맞춥니다.
   2. 다중 채널 프로브에 인접한(겹치지 않는) 조직 영역 위에 빛을 집중시킵니다.
   3. 고출력(40x 또는 60x) 침수 대물렌즈를 맞물리고 다중 채널 프로브와 대물 렌즈 사이의 접촉을 피하도록 주의하십시오.
   4. 필터 큐브 터렛을 회전하여 적절한 필터 세트를 작동시켜 Cre 의존성 형광 마커를 발현하는 세포의 이미징을 허용합니다.
   5. 형광 표지된 세포를 패치 클램프 기록의 대상으로 식별합니다. 대물 렌즈를 올려 패치 피펫을 내릴 수 있는 충분한 공간을 만듭니다.
3. 패치 피펫(표 1 참조)에 내부 용액(표 2)을 넣고 피펫을 전극 홀더에 장착합니다. 1mL 주사기를 사용하여 ~0.1mL 공기에 해당하는 양압을 가합니다.
4. 패치 피펫을 용액에 내립니다. 시각적 안내에 따라 피펫 팁에 초점을 맞춥니다.
5. 이전에 입증된 단계를 사용하여 표적 세포에서 전체 세포 기록을 얻습니다33.
6. 셀의 고유 특성(예: 입력 저항, 현재 단계에 대한 반응으로 활동전위 발화율)에 대한 변화를 평가하려는 경우 이러한 기록을 수행합니다. 그렇지 않으면 아래의 축삭 자극 프로토콜로 이동하십시오.

표 1: 인공 대뇌척수액과 세포내 용액의 구성. eACSF에 대한 시약 및 농도, 패치 클램프 기록을 위한 세포 내 피펫 용액이 나열되어 있습니다.

의 분 분 분 의 분 분 개

	실험 ACSF, eACSF(mM)
염화나트륨	111
나HCO3	35
헤페스	20
케이클	1.8
염화나트륨2	2.1
마그네슘SO4	1.4
KH2PO4	1.2
포도당	10
	내부 솔루션
K-글루코네이트	140
염화나트륨	10
헤페스	10
에그타	0.1
마그네슘 ATP	4
나GTP	0.3
	pH = 7.2

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
2.5x 광시야 대물 렌즈	올림푸스	MPLFLN2.5배
40x Water Immersion 대물 렌즈	올림푸스	LUMPLFLN40XW
95% O2/5% CO2 혼합물	에어가스	Z02OX95R2003045
A16 프로브	뉴로넥서스(NeuroNexus	A16x1-2mm-100-177-A16	16채널 프로브
마취 가스 모니터(POET II)	크리티케어	602-3ᅡ
염화칼슘 (CaCl2)	닷 사이언티픽	DSC20010	증권 시세
모세관 유리(패치 클램프 녹음)	킹 정밀 유리, Inc.	KG-33	붕규산염, ID: 1.1mm, OD: 1.7mm, 길이: 90.0mm
모세관 유리(바이러스 주사)	드러먼드 사이언티픽 컴퍼니	3-000-203-G/X	3.5인치
주니어 micromanipulator 제어	루이그스와 노이만	SM8	주니어 MicroManipulator 제어용
매니퓰레이터 및 이동 테이블 제어	루이그스와 노이만	SM7	Multichannel Electrode 및 Shifting Table 제어용
디지데이터 1440A + 클램프펙스 10	분자 장치	1440ᅡ	디지타이저 및 소프트웨어
E-3603 튜빙	피셔 사이언티픽	14171208	95% O2/5% CO2 가스 혼합물을 배양 챔버로 전달 + 패치 클램핑 중 압력 가압
에그타	닷 사이언티픽	DSE57060	세포내 솔루션
ERP-27 EEG 참조/패치 패널	뉴럴릴스	은퇴한
충전 바늘	세계적인 정밀 기기	50821912	패치 클램프 피펫 주입용
EYFP 이미징을 위한 필터 큐브	올림푸스	U-MRFPHQ
여과지	피셔 사이언티픽	09801E	조직 블록을 준비하는 동안 슬라이스 템플릿 위에 놓기
화염/갈색 마이크로피펫 풀러	셔터 계기	P-1000	2.5x2.5 박스 필라멘트
가스 분산 튜브	시그마 알드리치	CLS3953312C
유리 주사기(100mL)	시그마 알드리치	Z314390	가스 밀봉 백 충전용
글루콘산, 칼륨염(K-글루코네이트)	닷 사이언티픽	DSG37020	세포내 솔루션
포도당	닷 사이언티픽	DSG32040	증권 시세
GTP, 나트륨 염	시그마 알드리치	G8877	세포내 솔루션
헤드스테이지-프로브 어댑터	뉴로넥서스(NeuroNexus	A16-OM16	16채널 프로브를 헤드스테이지 입력에 연결하기 위한 어댑터
헤페스	닷 사이언티픽	DSH75030	ACSF, 세포내 용액
HS-16 헤드스테이지	뉴럴릴스	은퇴한
이소플루란	패터슨 수의학	TEL.07-893-1389
이소프로필 알코올 (70%)	VWR 국제공항	제101223-746
주니어 마이크로 매니퓰레이터	루이그스와 노이만	210-100 000 0090-R	Patch Clamp 전극의 조작을 위해
LED 광원 제어 모듈	마이텍스	BLS-PL02_US	광유전학 광원 제어
Lynx-8 앰프	뉴럴릴스	은퇴한
Lynx-8 전원 공급 장치	뉴럴릴스	은퇴한
황산마그네슘(MgSO4)	닷 사이언티픽	DSM24300	증권 시세
mCherry, 텍사스 레드 필터 큐브	크로마	49008	tdTomato 형광 리포터 이미징용
멜록시캠
마이크로피펫 홀더	피셔 사이언티픽	NC9044962
마이크로 주사기 펌프	세계적인 정밀 기기	UMP3-4 (영어
멀티클램프 700A	분자 장치/축삭 기기	700ᅡ	증폭기
질소(에어 테이블용)	에어가스	NI200
나일론 메쉬	피셔 사이언티픽	501460083	납작한 백금 와이어의 말굽 위로 뻗어 있는 Slice는 녹음 중에 그 위에 놓입니다
나일론, 팬티스타킹 컷	일반 브랜드		인큐베이션 챔버에서 슬라이스 플랫폼을 만드는 작은 조각, 백금 하프를 만들기 위한 단일 섬유
피펫	닷 사이언티픽	307	조직을 리그로 옮기기 위해
백금 와이어	VWR 국제공항	BT124000	플래티넘 하프를 만들기 위해 2cm, 평평하게
폴리곤400	마이텍스	DSI-E-0470-0617-000	광유전학 광 전달 시스템, PolyScan2 소프트웨어와 함께 제공
염화칼륨(KCl)	닷 사이언티픽	DSP41000	증권 시세
인산칼륨 (KH2PO4)	닷 사이언티픽	DSP41200	증권 시세
밀봉된 가스 백	피셔 사이언티픽	109236
현미경용 이동 테이블	루이그스와 노이만	380FMU
중탄산나트륨 (HCO3-)	닷 사이언티픽	DSS22060	증권 시세
염화나트륨(NaCl)	닷 사이언티픽	DSS23020	ACSF, 세포내 솔루션
주사기(1mL), LuerLock 팁 포함	피셔 사이언티픽	309628	패치 클램핑 중 압력 가공용
슬립 팁이 있는 주사기(1mL)	WW 그레인저, Inc.	AN-번호 19G384	패치 클램프 피펫 주입용
주사기 필터	VWR 국제공항	66064-414
정립 현미경	올림푸스	BX51
와이폴 타월	피셔 사이언티픽	Tel.: 19-042-427

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