VTA 도파민 뉴런 수용체 조작을 사용한 쥐 모델에서 도파민 방출 모니터링

초록

출처: Wickham, RJ, et al. 파식 도파민의 복부 피개 영역 수용체 조절을 평가하기 위해 CIS-FSCV(Fast-Scan Cyclic Voltammetry)와 결합 주입 및 자극. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 마취된 쥐에 전극과 캐뉼라를 이식하여 전위차점 측좌핵의 도파민 방출을 측정하고 복부 피개 영역의 도파민 활성을 조절하기 위한 약물 주입을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 수술 전 준비

1. 전극 용액 준비
   1. 전극 백필 용액을 만들려면 4mM 염화칼륨이 있는 140M 초산 칼륨 용액을 준비합니다.
2. 전극 준비
   1. 진공 흡입을 사용하여 T-650 탄소 섬유(직경 7μm)를 붕규산 유리 모세관(길이 = 100mm, 직경 = 1.0mm, 내경 = 0.5mm)에 삽입합니다.
   2. 탄소 섬유가 유리 모세관 내부에 배치되면 유리 모세관을 수직 전극 풀러에 넣고 발열체가 모세관의 대략 중앙에 위치하도록 합니다. 자석을 끈 상태에서 히터를 55로 설정합니다.
   3. 모세관을 당긴 후 전극 끝이 발열체에 둘러싸이지 않도록 상부 모세관 홀더를 조심스럽게 올립니다.
   4. 날카로운 가위를 사용하여 모세관의 두 부분을 여전히 연결하고있는 탄소 섬유를 자릅니다. 이것은 두 개의 분리된 탄소 섬유 미세 전극을 생성하게 됩니다.
   5. 광학 현미경으로 날카로운 메스로 노출된 탄소 섬유를 조심스럽게 잘라 유리 끝을 넘어 약 75-100μm까지 확장되도록 합니다.
   6. 광학 현미경을 사용하여 전극에 모세관을 따라 균열이 없는지, 탄소 섬유가 모세관에서 나오는 씰이 눈에 띄기 어렵고 균열이 없는지 확인합니다.
      메모: 밀봉이 잘되면 녹음 중 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다.
3. 기준 전극 제작
   1. 금핀을 5cm 은선에 납땜합니다.
   2. 양극을 금속 종이 클립 또는 기타 도체에 부착하고 음극을 핀에 부착하고 종이 클립과 은선을 0.1M HCl에 담근 상태에서 전압(~2V)을 가합니다.
   3. 은선에 흰색 코팅(AgCl)이 나타나면 전압을 중단하십시오.
4. 이식을 위한 전극 준비
   1. 얇은 절연 전선(길이 ~10cm, 직경 <0.50mm)에 금핀을 납땜합니다.
   2. 금색 핀 반대쪽 전선에서 절연체를 ~5cm 제거합니다.
   3. 전극 용액으로 전극을 대략 절반 정도 채웁니다.
   4. 절연 전선을 전극에 삽입합니다.
      메모: 와이어는 전극 내부의 탄소 섬유와 접촉해야 합니다.

2. 전극 이식

1. 성체, 수컷, Sprague Dawley 쥐(250-450g)에게 멸균 식염수에 용해된 0.5g/mL 우레탄의 복강내 주사(1.5g/kg 또는 1mL/kg 용량)를 제공합니다. 초기 우레탄 복용량은 1.0-1.2g/kg으로 시작합니다. 우레탄 투여 후 20분 후에도 동물이 유독성 자극 테스트(꼬리 꼬집기)에 여전히 반응하는 경우 1.5g/kg 총 투여량에 대해 추가로 0.3−0.5g/kg 우레탄을 투여합니다.
   메모: 0.5g/mL 우레탄 용액을 준비하려면 식염수 10g(~10mL)에 우레탄 10g을 추가합니다. 우레탄은 발암 물질이므로 주의해서 다루어야 합니다. 그러나 케타민/자일라진 및 클로랄 수화물과 같은 다른 마취제와 마찬가지로 도파민 수치를 변경하지 않기 때문에 중요한 마취제입니다.
2. 동물이 깊이 마취되고 유해한 자극(예: 발가락 꼬집음)에 반응하지 않으면 입체 안경테에 놓습니다. 쥐의 각 눈에 안과 윤활제를 바르십시오.
   메모: 이것은 생존이 불가능한 수술이지만 좋은 무균 기술이 권장됩니다.
3. 2단계 스크럽을 사용하여 쥐의 두피를 청소합니다(즉, 요오드포비돈 스크럽 후 70% 에탄올 스크럽, 3주기 반복).
4. 멸균된 바늘, 코 핀셋, 수술용 가위를 사용하여 두피 조직을 잘라냅니다. 아래에 설명된 다양한 이식을 위한 공간을 만들기 위해 상당한 양의 조직을 제거하십시오.
5. 멸균된 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골 표면을 부드럽게 청소합니다. 그런 다음 3% 과산화수소 2-3방울을 바르면 람다와 브레그마를 식별하는 데 도움이 됩니다.
6. 입체식 또는 핸드 드릴(1.0mm, ~20,000rpm)을 사용하여 브레그마 앞쪽 2.5mm, 브레그마 측면 3.5mm 직경의 1.5mm 구멍을 뚫습니다. 부분적으로(제자리에 단단히 고정될 때까지 약 절반) 이 구멍에 나사(1.59mm OD, 3.2mm 길이)를 삽입합니다. 열 손상을 방지하기 위해 드릴링하는 동안 관개하기 위해 멸균 식염수를 사용하는 것이 좋습니다.
7. 기준 전극의 경우 좌반구에서 브레그마 앞쪽 1.5mm, 측면 3.5mm 직경의 1.0mm 구멍을 뚫습니다.
8. 손으로 ~2mm의 참조 와이어를 이 구멍에 삽입하면서 이식된 나사의 머리 주위와 아래에 참조 와이어를 감습니다.
9. 나사를 완전히 삽입하고 기준 전극을 제자리에 고정합니다.
10. 우반구에서 브레그마 앞쪽 1.5mm, 측면 1.4mm의 직경 1.5mm의 구멍을 뚫습니다.
11. 핀셋을 사용하여 경막을 부드럽게 제거합니다.
12. 자극 전극의 경우 브레그마의 뒤쪽 5.2mm, 측면 5.2mm를 중심으로 사각형 구멍(2mm 전방-후방, 5mm 내측-외측)을 뚫습니다.
13. 정위 암 바를 사용하여 양극성 자극 전극/가이드 캐뉼라를 경막 아래로 5mm 내립니다. 전극 이식 중 출혈이 발생한 경우 멸균 면봉과 거즈를 사용하여 출혈을 최소화하십시오.
    메모: 이 방법에 사용되는 바이폴라 자극 전극에는 가이드 캐뉼라(Table of Materials)가 미리 장착되어 있습니다. 이 항목과 함께 사용되는 내부 캐뉼러는 가이드 캐뉼라에 완전히 삽입되었을 때 바이폴라 자극 전극의 갈래와 함께 플러시되어야 합니다. 이렇게 하면 내부 캐뉼라가 약 1mm 떨어진 자극기의 두 갈래 사이에 직접 위치할 수 있습니다. 유사한 프로토콜이 다른 곳에 설명되어 있습니다.
14. 정위 암 바를 사용하여 탄소 섬유 미세 전극을 경막 아래로 4mm 내립니다. 이 위치는 선조체의 가장 등쪽 부분입니다.
15. 기준선과 탄소 섬유를 전위차 조절기에 연결합니다.
16. 삼각형 파형(-0.4−1.3 V, 400 V/s)을 60 Hz에서 15분 동안 적용하고 다시 10 Hz에서 10분 동안 적용합니다.
    메모: 일반적으로 뇌의 탄소 섬유 미세 전극에 파형을 적용할 때 탄소 섬유 표면에 산화물 그룹이 추가됩니다. 이 반응의 평형은 기록하기 전에 도달해야 합니다. 그렇지 않으면 상당한 드리프트가 발생합니다19. 더 높은 주파수(60Hz)에서 전극을 순환하면 탄소 섬유가 더 빨리 평형을 이룰 수 있습니다.

3. 탄소 섬유 최적화 및 전극/가이드 캐뉼러 위치 자극

1. 60Hz의 주파수, 24개의 펄스, 300μA 전류 및 2ms/위상의 펄스 폭을 가진 바이폴라 전기 파형을 생성하도록 자극기를 설정합니다.
2. 경막 아래 5mm에서 7.8mm로 0.2mm씩 자극기를 부드럽게 내립니다. 각 증분에서 VTA.
   를 자극합니다. 메모: 더 많은 등쪽 깊이(5-6mm)에서 뇌의 자극은 일반적으로 (시간의 ~80%) 쥐의 수염을 경련하게 만듭니다. 더 깊은 곳에서는 수염의 경련이 멈추며 경막 아래 7.5-8.2mm 사이에서 발생합니다. 수염이 경련을 멈추면 자극 전극이 VTA 근처 또는 VTA에 있게 됩니다. 이것은 모든 쥐에서 발생하는 것은 아니며, 수염 경련이 없다고 해서 양극성 자극 전극/주입 캐뉼라가 잘못 배치되었다는 신호로 받아들여서는 안 됩니다. 수염 경련은 모든 마취제(예: 이소플루란)에서 발생하지 않을 수 있습니다.
3. 자극이 탄소 섬유 미세 전극(현재 등쪽 선조체에 있음)에서 위상 DA 방출을 생성할 때까지 양극성 자극 전극/가이드 캐뉼라를 계속 내립니다.
   메모: 양극성 전극이 VTA에 이식된 경우 등쪽 선조체에서 DA 방출이 항상 발생하는 것은 아니지만, VTA 자극 시 등쪽 선조체에서 DA 방출이 관찰되는 것은 일반적으로 NAc 코어에서 좋은 신호가 관찰될 것이라는 좋은 신호입니다.
4. 탄소 섬유 미세전극이 듀라에서 최소 6.0mm 아래에 있을 때까지 내립니다. 이것은 NAc 코어의 가장 등쪽 부분입니다.
5. VTA를 자극하고 DA 피크의 피크 진폭을 기록합니다.
6. 가장 큰 DA 방출을 생성하는 현장에서 탄소 섬유 미세 전극을 낮추거나 올립니다.
7. DA 응답 피크가 0.6V에서 명확한 산화 피크이고 -0.2V에서 감소 피크인지 확인합니다. 이 피크는 DA를 나타냅니다.

4. 조합 주입 및 자극 FSCV 기록

참고: 그림 1은 VTA 미세주입 전후를 기록하기 위한 타임라인을 보여줍니다.

1. 탄소 섬유와 자극 전극/가이드 캐뉼러 위치가 최적화되면 ~20−30분 동안 자극합니다.
   메모: 현재 자극 매개변수에서는 수포가 재장전될 수 있도록 3분에 한 번 이상 자극하지 마십시오22.
2. 안정적인 기준선(5회 자극에 걸쳐 <20% 변동)을 달성한 후 바이폴라 자극기에 미리 장착된 가이드 캐뉼라에 손으로 내부 캐뉼라를 부드럽게 내립니다.
3. 캐뉼라 삽입 자체가 유발된 신호를 변경하지 않았는지 확인하기 위해 추가 2-3 기준선 녹음을 수행합니다. 경우에 따라 내부 캐뉼라를 삽입하고 제거하면 VTA가 손상될 수 있습니다. 신호가 이 기준선 기간(>20%) 동안 급격히 변하는 경우 기준선이 다시 안정화될 때까지 추가로 3-4회 녹음합니다.
4. 주사기 펌프와 마이크로 주사기를 사용하여 0.5μL의 용액(예: 0.9% 식염수, N-메틸-D-아스파르테이트[NMDA], (2R)-아미노-5-포스포노발레르산[AP5])을 2분 동안 VTA에 주입합니다.
5. 주입 후 제거하기 전에 내부 캐뉼라를 최소 1분 동안 그대로 두십시오.
   메모: 일부 약물은 약물 역학에 따라 내부 캐뉼라를 더 오랜 시간 동안 방치해야 할 수 있으며, 내부 캐뉼라를 제거하면 약물이 내부 캐뉼라를 통해 다시 위로 이동할 수 있습니다. 우려되는 경우 녹음이 진행되는 동안 가이드 캐뉼라에 내부 캐뉼러를 남겨둘 수 있습니다. 그렇지 않으면 이 1분 간격 후에 녹음을 시작할 수 있습니다.
6. 주입 후 효과를 측정하기 위해 3분마다 계속 기록합니다.
   메모: 대조 용액을 주입하고 효과가 관찰되지 않으면 두 번째 주입이 가능합니다10. 내부 캐뉼라 또는 식염수 주입 삽입으로 인해 변경된 DA 방출이 있는 경우 신호는 일반적으로 30분 이내에 기준선으로 회복됩니다.

결과

그림 1: VTA 마이크로주입 전후를 기록하기 위한 타임라인.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
전극 충전 용액/공급품
마이크로피펫	세계적인 정밀 기기	MF286-5 (28 게이지)
칼륨 아세테이트	시그마	236497-100지
염화칼륨	시그마	P3911-25G
전극 공급 장치
탄소 섬유	소넬	T650
전극 풀러	나리시게 국제공항	체육-22	참고: 수평 풀러도 사용할 수 있습니다
유리 모세관	A-M 시스템	626000
전극용 절연 전선	Weico 와이어 및 케이블 통합	UL 1423	길이; 10 cm; 직경, 0.4mm; 주문품을 얻어야 한다; 격리된 물자는 철사의 5 cm를 커버해야 한다
Light Microscope (전극 관찰 및 절단용)	피셔 사이언티픽	M3700
핀	피닉스 엔터프라이즈	HWS1646	절연된 전극 와이어 및 기준 전극에 납땜되며, 헤드스테이지에 연결됩니다
퍼 티	알콜린	23922-1003	탄소 섬유를 절단하는 동안 전극을 놓는 데 사용됩니다.
스칼 블레이드	세계적인 정밀 기기	500239	탄소 섬유를 적절한 길이로 절단하기 위해
실버 와이어	시그마	327026-4지
FSCV 하드웨어/소프트웨어
패러데이 케이지	U-라인	H-3618(36인치 x 24인치 x 42인치)
전위차(Potentiostat)	Univ. of N. Carolina, 전자 시설
자극 전극	플라스틱원	MS303/2-A/SPC	주문 시 받침대 아래 22mm 절단을 요청하십시오
TarHeel HDCV 소프트웨어	노스 캐롤라이나 대학교 - 채플 힐	-	주문 정보 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI 브레이크아웃 박스	Univ. of N. Carolina, 전자 시설		주문 정보 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
UEI 전원 공급 장치	Univ. of N. Carolina, 전자 시설		주문 정보 https://chem.unc.edu/critcl-main/criticl-electronics/criticl-electronics-hardware/
Stimulator 하드웨어
Neurolog stimulus isolator (뉴로로그 자극 아이솔레이터)	디지타이머	DS4	뉴로로그 800A
주입/자극 용품
주입 펌프	New Era 주사기 펌프	NE-300
내부 캐뉼러	플라스틱원	C315I/SPC 내부 33GA
마이크로리터 주사기	해밀턴	80308
배관	플라스틱원	C313CT/ PKG 튜빙 023 X 050 PE50
수술 용품
캐뉼러 홀더	Kopf 악기	1776년 P-1
코튼 팁 어플리케이터	바이탈리티 메디컬	806
전극 홀더	Kopf 악기	1770
히팅 패드	켄트 사이언티픽	RT-0501
포비돈 요오드	바이탈리티 메디컬	제29906-004
나사	스톨팅	뼈 앵커 나사/Pkg.of 100	1.59mm 외경, 3.2mm 길이
AgCl을 사용한 은 와이어 참조	InVivo 미터법	E255A는
스퀘어 거즈	바이탈리티 메디컬	441408
스테레오택스	Kopf 악기	모델 902(듀얼 암 바)
주입용 약물
((2R)-아미노-5-포스포노발레르산	시그마 알드리치	A5282
N-메틸-D-아스파르테이트	시그마 알드리치	M3262
메카밀라민 염산염 (M9020-5mg)	시그마 알드리치	M9020
스코폴라민 하이드로브로마이드(S0929-1g)	시그마 알드리치	S0929

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