Whole-Cell Patch Clamp를 사용하여 Kisspeptin Neurons에 대한 테스트 성장 호르몬 효과 결정

초록

출처: Silva, J. d. N., et al., 전체 세포 패치 클램프 기록의 대상으로서의 시상하부 키스펩틴 뉴런. J. Vis. 특급 (2023)

이 비디오는 transfection된 마우스 시상하부 절편에서 키스펩틴 뉴런의 반응을 측정하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 프로세스에는 전체 세포 구성을 달성하고 전류 클램프 모드를 사용하여 테스트 호르몬에 의해 유도된 막 전위 변화를 기록하는 작업이 포함됩니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 기록용 셀 밀봉

1. 녹음을 시작하기 전에 모든 장비(현미경, 증폭기, 디지타이저, 미세 조작기 등)가 켜져 있는지 확인하십시오.
2. 상업용 브랜드(Table of Materials)의 기록 챔버를 채우고 녹음용 aCSF 솔루션으로 현미경에 부착합니다. 관류 펌프를 사용하여 2mL/분의 속도로 aCSF를 지속적으로 관류합니다.
3. 관심 있는 뇌 절편을 (한 번에 하나씩) 녹음실로 옮깁니다. 아크릴 전사 피펫(실리콘 젖꼭지에 부착된 역 파스퇴르 유리 피펫)을 사용하여 시상하부 슬라이스를 챔버로 옮깁니다. 슬라이스 앵커(Table of Materials)를 사용하여 aCSF 관류 중에 움직이지 않도록 슬라이스를 고정합니다.
4. 현미경에 부착된 기록실의 중앙에 슬라이스를 놓습니다. 슬라이스 위치는 현미경으로 원하는 영역을 잘 볼 수 있고 기록 마이크로피펫에 완벽하게 도달하기 위해 매우 중요합니다.
5. 침지 현미경의 저전력 대물 렌즈(10x 또는 20x)를 사용하여 슬라이스를 배치하고 관심 영역을 찾는 데 도움을 줍니다.
6. 관심 영역을 찾은 후 대물 렌즈를 고출력 렌즈(63x)로 전환하고 조직 수준에 초점을 맞추고 대상 영역에서 내인성 형광 단백질과 세포의 모양을 관찰하여 뇌 절편 표면에서 키스펩틴 세포를 찾습니다.
7. 가능한 대상 셀을 찾으면 마우스 커서를 사용하거나 관심 영역 위에 사각형과 같은 형식을 그려 컴퓨터 화면에 표시합니다. 컴퓨터 화면 표시는 기록 마이크로피펫의 위치를 세포로 안내하는 데 도움이 됩니다.
8. 타겟 세포의 정확한 위치를 결정한 후 대물렌즈를 들어 올리고 내부 용액으로 채워진 기록 마이크로피펫을 도입합니다. 전극 홀더에 마이크로피펫을 넣을 때 내부 용액이 은 전극과 접촉하고 있는지 확인하십시오.
   메모: 마이크로피펫 준비, 전극 홀더에 배치 및 위치 지정용.
9. 폴리에틸렌 튜브(≈130cm 더 길게)를 통해 마이크로피펫 홀더에 연결된 1-3mL 공기 충전 주사기를 사용하여 마이크로피펫에 이물질이 유입되는 것을 방지하기 위해 마이크로피펫을 aCSF 용액에 담그기 전에 양압을 가합니다.거의 100-200μL의 공기를 적용합니다.
10. 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 마이크로피펫을 대물렌즈 중앙 아래로 안내합니다. 마이크로매니퓰레이터의 버튼을 움직여 X-Y-Z 축의 마이크로피펫을 관심 세포 쪽으로 안내합니다.
11. 마이크로피펫의 끝을 보도록 초점을 조정하고 초점을 슬라이스에 너무 가깝지 않게 더 가깝게 가져옵니다. 마이크로매니퓰레이터의 속도를 줄이고 마이크로피펫을 초점면으로 천천히 내립니다. 마이크로피펫 팁이 절편을 갑자기 관통하지 않고 세포/표적 영역의 표면에 닿을 때까지 천천히 내려가는지 확인합니다.
12. 마이크로피펫 홀더에 부착된 1-3mL 공기 충전 주사기로 가벼운 양압(≈100μL)을 가하여 접근 경로에서 이물질을 제거합니다.
13. 표적 세포에 초점을 맞추고 X-Y-Z 축에서 마이크로매니퓰레이터를 천천히 움직여 마이크로피펫을 더 가까이 가져옵니다. 마이크로피펫을 세포에 접촉할 때 마이크로피펫 팁을 통해 가해지는 압력으로 인한 딤플이 관찰됩니다(그림 2C).
14. 딤플을 형성한 후, 마이크로피펫이 세포에 근접하기 때문에 마이크로피펫 홀더에 연결된 튜브를 통해 입으로 약하고 짧게 흡입하여(1-2초) 마이크로피펫과 셀 사이의 밀봉을 생성하십시오(기가 옴 씰 또는 기가 씰 >1 GΩ; 그림 2D). 씰을 형성하려면 vol을 사용하십시오.tage-clamp 소프트웨어의 모드.
15. 씰이 안정적으로 유지되면(기가 옴 씰은 기계적으로 안정적이어야 하며 약 1분 동안 관찰하여 결정된 노이즈 간섭이 없어야 함) 유지 전압을 관심 세포의 가장 가까운 생리학적 휴지 전위로 설정합니다. 키스펩틴 시상하부 뉴런의 경우 -50mV가 권장됩니다.
16. 원형질막을 파괴하기 위해 세포에 밀봉된 마이크로피펫으로 입으로 짧게 흡입(음압)합니다(그림 2E). 파열된 멤브레인이 마이크로피펫을 막지 않고 멤브레인 또는 세포의 상당한 부분을 끌어당기지 않도록 충분한 힘으로 흡입을 수행할 때 적절한 전체 세포 구성이 달성됩니다.
17. 사용된 시스템 설정 설명서를 확인하십시오. 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 직렬 저항(SR)과 전체 셀 커패시턴스(WCC)를 디지털 방식으로 확인하고 계산할 수 있습니다.
18. 전압 클램프 모드에서 세포막을 파괴한 후 전체 셀 옵션을 활성화하고 전체 셀 탭을 참조하는 자동 명령을 클릭합니다. 셀의 SR 및 wcc는 자동으로 계산되어 소프트웨어에 의해 즉시 표시됩니다. 이러한 매개변수는 Table of Materials에 언급된 증폭기로 멤브레인 테스트를 수행하여 확인할 수도 있습니다.
19. 세포 생존율 매개변수를 확인하십시오. 키스펩틴 뉴런의 경우 전기 생리학적 측정이 SR < 25mΩ, 입력 저항 > 0.3GΩ, 유지 전류 절대 값이 30pA<인지 확인합니다. AVPV/PeNKisspeptin 또는 ARHkisspeptin 뉴런의 WCC의 평균값은 생식선 온전한 마우스에서 10-12pF로 ≈
.
20. 실험 중에 SR 및 셀 정상 상태 커패시턴스를 모니터링합니다. 기록 중에 SR이 20% 이상 변경되지 않고 멤브레인 커패시턴스가 안정적인지 확인합니다.
21. 소프트웨어 설정을 확인하십시오. 실험 유형에 따라 녹음을 위한 특정 프로토콜을 만듭니다. 전류 클램프 모드에서 멤브레인 전위를 기록하려면 재료 표에 언급된 장비를 사용하여 저역 통과 신호를 2-4kHz에서 전기 생리학적 신호를 필터링하고 소프트웨어에서 오프라인으로 결과를 분석합니다(소프트웨어 정보는 재료 표 참조).
22. 전체 셀 구성이 제대로 달성되면 전압 클램프 모드에서 시냅스 전류를 측정합니다(그림 2G). 전류 클램프 모드에서 휴지 막 전위(RMP) 및 유도 RMP 변동의 변화를 기록합니다(그림 2H). 세포막의 탈분극과 같은 RMP의 변화는 그림 1.
    와 같이 알려진 약물/신경전달물질을 수조에 투여하여 유도할 수 있습니다(1.2단계에서 설명). 메모: 전류 클램프 모드에서는 양전류 또는 음전류를 주입하여 멤브레인 전압을 원하는 전압으로 유지할 수 있습니다. 키스펩틴 뉴런의 경우, 우리는 일반적으로 막 전위의 자발적인 변화를 기록하기 위해 0 전류 주입(I = 0)을 설정합니다.

결과

그림 1: 키스펩틴 뉴런의 활동에 대한 지식에 대한 전체 세포 패치 클램프 기술의 기여도를 요약한 개략도. 키스펩틴 뉴런(녹색으로 표시)은 전복부 뇌실주위핵(anteroventral periventricular nuclei, AVPV/PeN)과 시상하부(hypothalamus)의 아치형 핵(arcuate nucleus)에 위치합니다. AVPV/PeNKisspeptin 및 ARHkisspeptin 세포는 전광학 영역(POA)에 위치한 성선 자극 호르몬 방출 호르몬(GnRH) 뉴런의 소마와 ME(median eminence)의 말단에 직접 연결하여 시상하부-뇌하수체 축(HPG)의 조절을 이룹니다. 호르몬과 같은 다양한 신경 조절 물질은 AVPV/PeNKisspeptin 및 ARHkisspept...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CSF, 내부 및 슬라이싱 솔루션용 컴파운드
ATP	시그마 알드리치/다양한	A9187
염화칼슘	시그마 알드리치/다양한	C7902
D-(+)-포도당	시그마 알드리치/다양한	G7021
에그타	시그마 알드리치/다양한	O3777
헤페스	시그마 알드리치/다양한	H3375 (영문
케이클	시그마 알드리치/다양한	P5405
K-글루코네이트	시그마 알드리치/다양한	G4500
코	시그마 알드리치/다양한	P5958
염화마그네슘	시그마 알드리치/다양한	M9272
마그네슘 황산염	시그마 알드리치/다양한	230391
염화나트륨	시그마 알드리치/다양한	S5886
인산나트륨	시그마 알드리치/다양한	S5011
중탄산나트륨	시그마 알드리치/다양한	S5761
장비
증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B
DIGIDATA 1440 저노이즈 데이터 수집 시스템	분자 장치	DD1440
디지털 연동 펌프	이스마텍	ISM833C
패러데이 케이지	티엠씨	81-333-03
이미징 카메라	라이카	DFC 365 FX
마이크로 매니퓰레이터	셔터 기기	알-200
마이크로피펫 풀러	나리시게	PC-10
현미경	라이카	DM6000의 일천초
회수 챔버	워너 인스트루먼트/하버드 기구	-
녹음실	워너 인스트루먼트	640277
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슬라이스 앵커	워너 인스트루먼트	Tel.: 64-0246

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