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검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.
1. 체외 전기생리학
- 척수 절편 준비 및 기록을 위한 용액 준비
- 인공 뇌척수액
메모: 인공 뇌척수액(aCSF)은 계면 배양실에서 사용되며, 기록이 시작될 때까지 그리고 실험 중에는 약물의 관류액 및 희석제로 절편을 보관합니다. 자세한 구성은 표 1을 참조하십시오.
- 118 NaCl, 25 NaHCO3, 10 포도당, 2.5 KCl, 1 NaH2PO4, 1 MgCl2 및 2.5 CaCl2를 함유하는 (mM 단위) aCSF를 CaCl2를 제외한 상기 수량을 증류수 2 L에 첨가하여 준비합니다.
- 위의 용액을 탄수화물 (95 % O2, 5 % CO2 )로 5 분 동안 거품을 일으키고 CaCl2.
를 추가합니다.
메모: 이 단계는 CaCl2 침전, 즉 용액이 흐려지지 않는 것을 방지합니다. 실험 중 약물 적용의 경우, aCSF의 원료 용액을 원하는 최종 농도로 희석합니다.
2. 자당 치환 인공 뇌척수액
참고: 자당 치환 aCSF는 절제 및 척수 절단 중에 사용됩니다. 이름에서 알 수 있듯이 자당은 삼투압을 유지하면서 이러한 절차 동안 신경 세포 흥분을 줄이기 위해 NaCl을 대체합니다. 자세한 구성은 표 1을 참조하십시오.
- CaCl2를 제외한 상기 모든 것의 필요량을 증류수 300 mL에 첨가하여 250 수크로스, 25 NaHCO3, 10 포도당, 2.5 KCl, 1NaH2PO4, 1 MgCl2 및 2.5 CaCl2를 함유하는(mM 단위) 슈크로스 치환 aCSF를 준비한다.
- 용액에 카보겐을 5분 동안 거품을 일으킨 다음 CaCl2를 추가합니다.
- 용액을 -80°C 냉동고에 약 40분 동안 또는 용액이 슬러리를 형성할 때까지 보관하십시오. 단단하게 얼지 말고 슬러리 농도에서 사용하십시오.
3. 미세 전극 어레이 준비
참고: MEA의 접촉면은 친수성으로 만들기 위해 전처리가 필요합니다.
- 실험하기 전에 MEA 웰을 소 태아 혈청(FBS) 또는 말 혈청(HS)으로 30분 동안 채웁니다.
- FBS 또는 HS를 제거하고 증류수가 더 이상 거품이 나지 않을 때까지 증류수를 약 5회 세척하여 MEA를 철저히 헹굽니다. 사용할 준비가 된 CSF로 우물을 채웁니다.
4. 급성 척수 절제 준비
- 100mg/kg 케타민(ip)으로 마우스를 깊숙이 마취한 다음 대형 수술용 가위를 사용하여 목을 베십시오.
- 엉덩이 높이의 피부를 작게 절개하여 복부 부위의 피부를 제거합니다. 모든 피부가 제거될 때까지, 즉 흉곽 상단에서 골반 상단까지(복부 및 등쪽 모두) 절단된 부위의 양쪽 피부를 옆으로 당깁니다.
- 시신을 얼음 위에 놓고 복부 접근법을 사용하여 모든 내장을 제거하고 흉골 측면의 갈비뼈를 절단하여 척추를 노출시킵니다.
- 복부 흉곽, 양쪽 견갑골(약 T2에서 절단), 하지와 골반(대략 천골 상단에서 절단)을 제거합니다.
- 척추와 갈비뼈 조제물을 얼음처럼 차가운 자당 aCSF가 들어 있는 해부 수조로 옮깁니다. 허리 근육과 부착된 위쪽 갈비뼈를 통해 핀을 삽입하여 준비물의 네 모서리(복부 표면을 위쪽으로)를 모두 고정합니다.
- 척추의 복부 표면 위에 있는 모든 근육과 결합 조직을 롱거(rongeurs)로 제거하고 T12에서 L2 척추체 아래에 대략 있는 요추 확대 위의 척추 부위를 확인합니다.
척추관에 - 있는 척수에 접근할 수 있도록 요추 비대 부위의 꼬리에 있는 척추체를 제거합니다.
- 구부러진 스프링 가위를 사용하여 척추 척추를 양측으로 자르면서 척추체를 배쪽으로 들어 올리고 당겨 척추의 배쪽과 등쪽 측면을 분리하고 척수를 노출시킵니다.
- 척추체를 제거하여 요추 비대가 드러나면 척수가 자유롭게 떠오를 때까지 스프링 가위로 척수를 고정하고 있는 나머지 뿌리를 조심스럽게 제거합니다.
- 요추 확대 부위의 위와 아래에 있는 주상부와 꼬리 절개가 있는 척수를 분리하여 척수의 목표 부위가 '자유롭게 떠다닐 수 있도록' 합니다.
메모: 선호되는 슬라이스 방향에 따라 절단을 위해 코드가 이후에 장착되는 방법이 결정됩니다(그림 1).
- 가로 슬라이스의 경우 부착된 뿌리로 요추 부분을 들어 올리고 중앙에 얕은 채널이 절단된 미리 절단된 폴리스티렌(스티로폼) 블록(1cm x 1cm x 1cm)에 놓습니다. 시아노아크릴레이트 접착제(재료 표 참조)를 사용하여 블록과 코드를 단면 플랫폼에 부착하고 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.
메모: 얕은 채널은 척수를 고정하고 방향을 잡는 데 도움이 되며, 등쪽은 노출되고 흉수 끝은 블록의 아래쪽에 있습니다.
- 시상 슬라이스의 경우, 단면 플랫폼에 시아노아크릴레이트 접착제의 얇은 선을 놓고, 부착된 뿌리로 요추 확대를 들어 올리고, 접착제 선을 따라 코드를 배치하여 한쪽 측면이 접착제에 있고 다른 측면이 위쪽을 향하도록 합니다. 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.
- 수평 슬라이스의 경우, 단면 플랫폼에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 펴 바르십시오. 부착된 뿌리로 요추 확대를 들어 올리고 접착제 라인을 따라 요추 확대를 배치하여 복부 표면이 접착제 안에 있고 등쪽 표면이 위쪽을 향하도록 합니다. 부착된 루트를 사용하여 코드를 배치합니다. 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.
5. 미세 전극 어레이 기록
참고: 다음 단계에서는 척수 절편에 대한 MEA 기반 실험의 기록 데이터를 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 실험에 따라 여러 MEA 설계를 사용할 수 있습니다. 이 실험에 사용된 MEA에 대한 설계 세부 사항은 표 2 및 그림 2에 나와 있습니다. Egert et al. 및 Thiebaud et al.은 각각 평면 및 3차원(3D) MEA에 대한 자세한 설계 정보를 발표했습니다. 두 MEA 유형 모두 60개의 질화티타늄 전극으로 구성되며, 질화규소 절연층과 질화티타늄 트랙 및 접촉 패드가 있습니다.
- 실험 설정
- 컴퓨터와 인터페이스 보드를 켜고 녹음 소프트웨어를 시작합니다.
- 사전 조립된 녹음 템플릿을 로드합니다(그림 3A). 레코더 탭에서 그날의 파일 이름을 지정합니다.
- 실험 기간 동안 aCSF를 탄수화물(5% CO2, 95% O2)로 지속적으로 거품을 일으
킵니다.
- 연동 펌프에 의해 제어되는 관류 시스템을 켭니다. 입구 라인을 CSF에 놓고 입구 끝을 폐기물 비커에 놓습니다. aCSF로 관류 라인을 프라임합니다.
- 50mL의 aCSF에 있는 원료를 필요한 최종 농도(예: 4-AP의 경우 200μM)로 희석하여 4-AP 및 기타 약물 용액을 준비합니다.
- 4-아미노피리딘(4-AP) 활성
- 배양 후 aCSF로 채워진 큰 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 인큐베이터에서 단일 슬라이스를 옮깁니다.
- 슬라이스를 MEA 웰에 놓고 aCSF를 추가합니다.
- 가는 짧은 머리 페인트 브러시를 사용하여 60전극 기록 어레이 위에 슬라이스를 놓습니다. 특히 3D 어레이를 사용하는 경우 전극을 페인트 브러시와 접촉시키거나 전극을 가로질러 조직을 드래그하지 마십시오.
메모: MEA 레이아웃에 따라 정확한 위치 지정을 위해 현미경의 도움을 받거나 받지 않고 이를 수행할 수 있습니다.
- 슬라이스를 배치한 후 조직 위에 가중 그물을 놓아 제자리에 고정하고 MEA 전극과의 양호한 접촉을 촉진합니다.
메모: 슬라이스는 네트 배치 후 재배치가 필요할 수 있습니다.
- MEA를 녹음 헤드스테이지에 놓습니다(그림 2A, B).
- 도립 현미경(2배 확대)을 사용하여 전극 위의 조직 위치를 확인하여 가능한 한 많은 전극이 표재성 등뿔(SDH) 아래에 있는지 확인합니다. 최소 2-6개의 전극이 슬라이스와 접촉하지 않도록 하십시오. 이러한 전극은 분석 중에 노이즈를 제거하고 아티팩트를 기록하는 데 중요하므로 이러한 전극은 슬라이스와 접촉하지 않습니다(그림 2E).
- 카메라를 켜고 장치에 연결한 다음 분석 중에 사용하기 위해 MEA를 기준으로 슬라이스의 참조 이미지를 촬영합니다.
- 레코딩 소프트웨어에서 Start DAQ (data acquisition)를 누르고 모든 전극이 명확한 신호를 수신하고 있는지 확인합니다.
메모: 신호에 잡음이 있으면 헤드스테이지를 풀고 MEA 접촉 패드와 금 스프링 접점을 모두 70% 에탄올로 청소합니다(청소 후 패드와 접점이 건조한지 확인하기 위해 실험실 닦음을 사용). 신호에 여전히 잡음이 있으면 녹음 소프트웨어에서 오작동하는 전극을 끄거나 나중에 분석 중에 제외할 수 있도록 기록해 두십시오.
- 관류 입구 및 출구 라인을 MEA 웰(이전에는 CSF로 채워짐)에 연결하고 관류 시스템을 켭니다. 유속, 이상적으로는 분당 4-6 욕 부피를 확인하고 유출이 과혼 화물의 오버플로를 방지하기에 충분한지 확인하십시오.
- 조직이 5분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 다음 5분 동안 여과되지 않은 원시 기준 데이터를 기록합니다.
- 관류 주입 라인을 CSF에서 4-AP 용액으로 이동하고 4-AP 유도 리듬 활동이 정상 상태에 도달할 때까지 12분 동안 기다립니다(약물이 수조에 도달하는 데 2분, 활동이 최고조에 도달한 후 안정기에 도달하는 데 10분).
- 5분 동안 4-AP로 유도된 활동을 기록합니다. 약물을 테스트하거나 4-AP의 안정성을 확인하기 위해 후속 녹음을 준비하십시오.
표 1: 인공 뇌척수액 조성물.
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| 화학 | aCSF(mM) | aCSF (g/100mL) | 자당 치환 aCSF(mM) | 자당 치환 aCSF (g/100 mL) | 고칼륨 aCSF(mM) | 고칼륨 aCSF (g/100mL) |
| 염화나트륨 (NaCl) | 118 | 0.690 아오 | - | - | 118 | 0.690 아오 |
| 탄산수소나트륨(NaHCO3) | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 | 25 | 0.210 |
| 포도당 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 | 10 | 0.180 |
| 염화칼륨(KCl) | 2.5 | 0.019 | 2.5 | 0.019 | 4.5 | 0.034 |
| 인산이수소나트륨 (NaH2PO4 ) | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 | 1 | 0.012 |
| 클로라이드마그네슘(MgCl2) | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 | 1 | 0.01 |
| 염화칼슘 (CaCl2 ) | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 | 2.5 | 0.028 |
| 자당 | - | - | 250 | 8.558 | - | - |
표 2: 미세 전극 어레이 레이아웃.
| 미세 전극 어레이 레이아웃 |
| 미세전극 어레이 모델 | 60MEA 200/30iR-Ti | 60-3DMEA 100/12/40iR-티 | 60-3DMEA 200/12/50iR-Ti | 60MEA 500/30iR-Ti |
| 평면 또는 3차원(3D) | 평면 | 3D (3D) | 3D (3D) | 평면 |
| 전극 그리드 | 8 엑스 8 | 8 엑스 8 | 8 엑스 8 | 6 엑스 10 |
| 전극 간격 | 200 μm의 | 100 μm의 | 200 μm의 | 500 μm |
| 전극 직경 | 30 μm의 | 12 μm의 | 12 μm의 | 30 μm의 |
| 전극 높이(3D) | 해당 사항 없음 | 40 μm의 | 50 μm의 | 해당 사항 없음 |
| 실험 | 가로 슬라이스 | 가로 슬라이스 | 시상 + 수평 | 시상 + 수평 |
