microelectrode array-based assessment of neuronal networks in mouse spinal cord slices(쥐 척수 절편에서 신경 네트워크에 대한 Microelectrode Array-based Assessment of Neuronal Networks in Mouse Spinal Cord Slices)

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 체외 전기생리학

1. 척수 절편 준비 및 기록을 위한 용액 준비
   1. 인공 뇌척수액
      메모: 인공 뇌척수액(aCSF)은 계면 배양실에서 사용되며, 기록이 시작될 때까지 그리고 실험 중에는 약물의 관류액 및 희석제로 절편을 보관합니다. 자세한 구성은 표 1을 참조하십시오.
2. 118 NaCl, 25 NaHCO₃, 10 포도당, 2.5 KCl, 1 NaH₂PO₄, 1 MgCl₂ 및 2.5 CaCl₂를 함유하는 (mM 단위) aCSF를 CaCl₂를 제외한 상기 수량을 증류수 2 L에 첨가하여 준비합니다.
3. 위의 용액을 탄수화물 (95 % O₂, 5 % CO₂ )로 5 분 동안 거품을 일으키고 CaCl₂.
   를 추가합니다. 메모: 이 단계는 CaCl₂ 침전, 즉 용액이 흐려지지 않는 것을 방지합니다. 실험 중 약물 적용의 경우, aCSF의 원료 용액을 원하는 최종 농도로 희석합니다.

2. 자당 치환 인공 뇌척수액

참고: 자당 치환 aCSF는 절제 및 척수 절단 중에 사용됩니다. 이름에서 알 수 있듯이 자당은 삼투압을 유지하면서 이러한 절차 동안 신경 세포 흥분을 줄이기 위해 NaCl을 대체합니다. 자세한 구성은 표 1을 참조하십시오.

1. CaCl₂를 제외한 상기 모든 것의 필요량을 증류수 300 mL에 첨가하여 250 수크로스, 25 NaHCO3, 10 포도당, 2.5 KCl, 1_NaH2PO4, 1 MgCl₂ 및 2.5 CaCl₂를 함유하는(mM 단위) 슈크로스 치환 aCSF를 준비한다.
2. 용액에 카보겐을 5분 동안 거품을 일으킨 다음 CaCl₂를 추가합니다.
3. 용액을 -80°C 냉동고에 약 40분 동안 또는 용액이 슬러리를 형성할 때까지 보관하십시오. 단단하게 얼지 말고 슬러리 농도에서 사용하십시오.

3. 미세 전극 어레이 준비

참고: MEA의 접촉면은 친수성으로 만들기 위해 전처리가 필요합니다.

1. 실험하기 전에 MEA 웰을 소 태아 혈청(FBS) 또는 말 혈청(HS)으로 30분 동안 채웁니다.
2. FBS 또는 HS를 제거하고 증류수가 더 이상 거품이 나지 않을 때까지 증류수를 약 5회 세척하여 MEA를 철저히 헹굽니다. 사용할 준비가 된 CSF로 우물을 채웁니다.

4. 급성 척수 절제 준비

1. 100mg/kg 케타민(ip)으로 마우스를 깊숙이 마취한 다음 대형 수술용 가위를 사용하여 목을 베십시오.
2. 엉덩이 높이의 피부를 작게 절개하여 복부 부위의 피부를 제거합니다. 모든 피부가 제거될 때까지, 즉 흉곽 상단에서 골반 상단까지(복부 및 등쪽 모두) 절단된 부위의 양쪽 피부를 옆으로 당깁니다.
3. 시신을 얼음 위에 놓고 복부 접근법을 사용하여 모든 내장을 제거하고 흉골 측면의 갈비뼈를 절단하여 척추를 노출시킵니다.
4. 복부 흉곽, 양쪽 견갑골(약 T2에서 절단), 하지와 골반(대략 천골 상단에서 절단)을 제거합니다.
5. 척추와 갈비뼈 조제물을 얼음처럼 차가운 자당 aCSF가 들어 있는 해부 수조로 옮깁니다. 허리 근육과 부착된 위쪽 갈비뼈를 통해 핀을 삽입하여 준비물의 네 모서리(복부 표면을 위쪽으로)를 모두 고정합니다.
6. 척추의 복부 표면 위에 있는 모든 근육과 결합 조직을 롱거(rongeurs)로 제거하고 T12에서 L2 척추체 아래에 대략 있는 요추 확대 위의 척추 부위를 확인합니다.
척추관에
7. 있는 척수에 접근할 수 있도록 요추 비대 부위의 꼬리에 있는 척추체를 제거합니다.
8. 구부러진 스프링 가위를 사용하여 척추 척추를 양측으로 자르면서 척추체를 배쪽으로 들어 올리고 당겨 척추의 배쪽과 등쪽 측면을 분리하고 척수를 노출시킵니다.
9. 척추체를 제거하여 요추 비대가 드러나면 척수가 자유롭게 떠오를 때까지 스프링 가위로 척수를 고정하고 있는 나머지 뿌리를 조심스럽게 제거합니다.
10. 요추 확대 부위의 위와 아래에 있는 주상부와 꼬리 절개가 있는 척수를 분리하여 척수의 목표 부위가 '자유롭게 떠다닐 수 있도록' 합니다.
    메모: 선호되는 슬라이스 방향에 따라 절단을 위해 코드가 이후에 장착되는 방법이 결정됩니다(그림 1).
11. 가로 슬라이스의 경우 부착된 뿌리로 요추 부분을 들어 올리고 중앙에 얕은 채널이 절단된 미리 절단된 폴리스티렌(스티로폼) 블록(1cm x 1cm x 1cm)에 놓습니다. 시아노아크릴레이트 접착제(재료 표 참조)를 사용하여 블록과 코드를 단면 플랫폼에 부착하고 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.
    메모: 얕은 채널은 척수를 고정하고 방향을 잡는 데 도움이 되며, 등쪽은 노출되고 흉수 끝은 블록의 아래쪽에 있습니다.
12. 시상 슬라이스의 경우, 단면 플랫폼에 시아노아크릴레이트 접착제의 얇은 선을 놓고, 부착된 뿌리로 요추 확대를 들어 올리고, 접착제 선을 따라 코드를 배치하여 한쪽 측면이 접착제에 있고 다른 측면이 위쪽을 향하도록 합니다. 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.
13. 수평 슬라이스의 경우, 단면 플랫폼에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 펴 바르십시오. 부착된 뿌리로 요추 확대를 들어 올리고 접착제 라인을 따라 요추 확대를 배치하여 복부 표면이 접착제 안에 있고 등쪽 표면이 위쪽을 향하도록 합니다. 부착된 루트를 사용하여 코드를 배치합니다. 얼음처럼 차가운 자당 aCSF(슬러리)가 들어 있는 절단 수조에 넣습니다.

5. 미세 전극 어레이 기록

참고: 다음 단계에서는 척수 절편에 대한 MEA 기반 실험의 기록 데이터를 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 실험에 따라 여러 MEA 설계를 사용할 수 있습니다. 이 실험에 사용된 MEA에 대한 설계 세부 사항은 표 2 및 그림 2에 나와 있습니다. Egert et al. 및 Thiebaud et al.은 각각 평면 및 3차원(3D) MEA에 대한 자세한 설계 정보를 발표했습니다. 두 MEA 유형 모두 60개의 질화티타늄 전극으로 구성되며, 질화규소 절연층과 질화티타늄 트랙 및 접촉 패드가 있습니다.

1. 실험 설정
   1. 컴퓨터와 인터페이스 보드를 켜고 녹음 소프트웨어를 시작합니다.
   2. 사전 조립된 녹음 템플릿을 로드합니다(그림 3A). 레코더 탭에서 그날의 파일 이름을 지정합니다.
   3. 실험 기간 동안 aCSF를 탄수화물(5% CO₂, 95% O₂)로 지속적으로 거품을 일으
   킵니다.
   4. 연동 펌프에 의해 제어되는 관류 시스템을 켭니다. 입구 라인을 CSF에 놓고 입구 끝을 폐기물 비커에 놓습니다. aCSF로 관류 라인을 프라임합니다.
   5. 50mL의 aCSF에 있는 원료를 필요한 최종 농도(예: 4-AP의 경우 200μM)로 희석하여 4-AP 및 기타 약물 용액을 준비합니다.
2. 4-아미노피리딘(4-AP) 활성
   1. 배양 후 aCSF로 채워진 큰 팁 파스퇴르 피펫을 사용하여 인큐베이터에서 단일 슬라이스를 옮깁니다.
   2. 슬라이스를 MEA 웰에 놓고 aCSF를 추가합니다.
   3. 가는 짧은 머리 페인트 브러시를 사용하여 60전극 기록 어레이 위에 슬라이스를 놓습니다. 특히 3D 어레이를 사용하는 경우 전극을 페인트 브러시와 접촉시키거나 전극을 가로질러 조직을 드래그하지 마십시오.
      메모: MEA 레이아웃에 따라 정확한 위치 지정을 위해 현미경의 도움을 받거나 받지 않고 이를 수행할 수 있습니다.
   4. 슬라이스를 배치한 후 조직 위에 가중 그물을 놓아 제자리에 고정하고 MEA 전극과의 양호한 접촉을 촉진합니다.
      메모: 슬라이스는 네트 배치 후 재배치가 필요할 수 있습니다.
   5. MEA를 녹음 헤드스테이지에 놓습니다(그림 2A, B).
   6. 도립 현미경(2배 확대)을 사용하여 전극 위의 조직 위치를 확인하여 가능한 한 많은 전극이 표재성 등뿔(SDH) 아래에 있는지 확인합니다. 최소 2-6개의 전극이 슬라이스와 접촉하지 않도록 하십시오. 이러한 전극은 분석 중에 노이즈를 제거하고 아티팩트를 기록하는 데 중요하므로 이러한 전극은 슬라이스와 접촉하지 않습니다(그림 2E).
   7. 카메라를 켜고 장치에 연결한 다음 분석 중에 사용하기 위해 MEA를 기준으로 슬라이스의 참조 이미지를 촬영합니다.
   8. 레코딩 소프트웨어에서 Start DAQ (data acquisition)를 누르고 모든 전극이 명확한 신호를 수신하고 있는지 확인합니다.
      메모: 신호에 잡음이 있으면 헤드스테이지를 풀고 MEA 접촉 패드와 금 스프링 접점을 모두 70% 에탄올로 청소합니다(청소 후 패드와 접점이 건조한지 확인하기 위해 실험실 닦음을 사용). 신호에 여전히 잡음이 있으면 녹음 소프트웨어에서 오작동하는 전극을 끄거나 나중에 분석 중에 제외할 수 있도록 기록해 두십시오.
   9. 관류 입구 및 출구 라인을 MEA 웰(이전에는 CSF로 채워짐)에 연결하고 관류 시스템을 켭니다. 유속, 이상적으로는 분당 4-6 욕 부피를 확인하고 유출이 과혼 화물의 오버플로를 방지하기에 충분한지 확인하십시오.
   10. 조직이 5분 동안 평형을 이룰 때까지 기다린 다음 5분 동안 여과되지 않은 원시 기준 데이터를 기록합니다.
   11. 관류 주입 라인을 CSF에서 4-AP 용액으로 이동하고 4-AP 유도 리듬 활동이 정상 상태에 도달할 때까지 12분 동안 기다립니다(약물이 수조에 도달하는 데 2분, 활동이 최고조에 도달한 후 안정기에 도달하는 데 10분).
   12. 5분 동안 4-AP로 유도된 활동을 기록합니다. 약물을 테스트하거나 4-AP의 안정성을 확인하기 위해 후속 녹음을 준비하십시오.

표 1: 인공 뇌척수액 조성물.

표 2: 미세 전극 어레이 레이아웃.

그림 1: 척수 절편 방향, 장착 및 절단 방법. (A) 가로 슬라이스에는 지지 홈이 절단된 스티로폼 절단 블록이 필요합니다. 척수는 지지 홈의 블록에 기대어 있으며, 탯줄의 등쪽은 블록에서 반대쪽을 향합니다. 블록과 코드는 시아노아크릴레이트 접착제로 절단 스테이지에 접착됩니다. (B) 시상 절편은 절단 단계에 얇은 선의 시아노아크릴레이트 접착제를 놓은 다음 척수를 접착제 옆으로 배치하여 준비합니다. (C) 수평 슬라이스는 절단 스테이지에 얇은 시아노아크릴레이트 접착제 선을 배치한 다음 척수 복부 쪽을 접착제에 아래로 향하게 배치하여 준비합니다.

그림 2: 미세전극 어레이의 조직 위치. (A) 이미지는 MEA가 제자리에 배치된 열린 MEA 헤드스테이지를 보여줍니다. (B) A와 동일하며 MEA 헤드스테이지가 녹음을 위해 폐쇄되고 조직 관류 시스템이 마련되어 있습니다. (C) 이미지는 제조업체에서 제공한 MEA를 보여줍니다. 헤드스테이지의 금색 스프링과 접촉하는 접촉 패드와 조직 목욕 용액과 조직 슬라이스를 담고 있는 MEA 조직 수조가 표시됩니다. 중앙의 빨간색 사각형으로 강조 표시된 영역은 전극 어레이의 위치입니다. (D) 회로도는 이 연구에 사용된 두 개의 MEA 전극 구성을 보여주며, 자세한 내용은 표 2에 나와 있습니다. 기준 전극은 파란색 사다리꼴로 표시됩니다. 왼쪽 MEA 전극 레이아웃은 60전극 정사각형 구성을 보여주며, 직경 30μm 전극이 200μm 간격으로 떨어져 있거나 200μm 간격 및 100μm 간격의 3차원 MEA(60MEA200/12/50iR-Ti 및 60MEA100/12/40iR-Ti)가 있는 제시된 작업 모델 60MEA200/30iR-Ti에서 가장 많이 사용됩니다. 각각. 왼쪽 MEA 전극 레이아웃은 6 x 10 전극 직사각형 레이아웃-60MEA500/30iR-Ti를 보여줍니다. (E) 기록을 위해 배치된 횡척수 절편이 있는 60MEA100/12/40iR-Ti 정사각형 MEA의 고배율 이미지. 슬라이스는 전극 열 3-8에 있습니다. 어떤 조직에도 접촉하지 않는 전극의 맨 윗줄은 기준 전극 역할을 합니다. SDH 영역은 반투명 띠로 나타납니다. 이 경우 SDH는 MEA의 4, 5, 6행과 2, 3, 4, 5, 7열의 전극 위에 놓입니다. 눈금 막대 = 200μm. 약어: MEA = microelectrode array; SDH = 표재성 등뿔.

그림 3: 데이터 기록 및 분석 도구 레이아웃과 세포 외 활동 전위 및 국소 자기장 전위 파형을 보여주는 미세 전극 어레이 기록 예. (A) 회로도는 MEA 데이터 수집에 사용되는 사전 구성된 기록 템플릿을 보여줍니다. MEA2100와 녹음(헤드스테이지/앰프) 도구를 연결하면 데이터의 이름을 지정하고 저장할 수 있습니다. 원시 데이터의 4가지 예시 추적(오른쪽, 5분 에포크)은 베이스라인에서의 활성, 4-AP 적용 후 12분, 설정된 4-AP 활성 후 추가 15분 및 TTX(1μM)의 수조 적용 후 활성을 보여주는 하나의 MEA 채널에 의해 수집되었습니다. 4-AP(두 번째 추적)를 추가하면 배경 소음과 EAP/LFP 활동이 확실히 증가합니다. 중요한 것은 4-AP 유도 활성이 확립된 후 최소 15분 동안 활성이 비교적 안정적으로 유지된다는 것입니다(세 번째 추적). TTX(1μM)를 추가하면 모든 활성(하단 트레이스)이 제거됩니다. (B) 회로도(왼쪽)는 데이터 분석을 위한 분석기 소프트웨어 구성을 보여줍니다. 원시 데이터 탐색기 도구는 녹음 소프트웨어에서 수집한 녹음을 가져오는 데 사용됩니다. 그런 다음 이러한 데이터는 배경 잡음을 제거하기 위해 다른 전극에서 선택한 기준 전극 신호를 빼는 교차 채널 필터 도구를 통해 실행됩니다. 데이터는 EAP 필터와 LFP 필터 도구를 통과하여 각 파형에 대한 신호 대 잡음 관계를 최적화합니다. 이 단계에 따라 EAP 경로 데이터는 임계값이 설정되는 EAP 탐지기 도구로 들어갑니다. EAP는 감지된 다음 EAP 분석기 도구로 전송되며, 여기서 각 이벤트의 지연 시간이 기록되고 txt로 내보내집니다. 파일. 해당 LFP 툴킷을 사용하여 LFP 데이터에 대해 동일한 워크플로가 발생합니다. 오른쪽 트레이스는 다양한 세포 외 파형을 포함하는 단일 MEA 채널의 데이터를 보여줍니다. EAP 및 LFP 신호의 위치는 위의 '카운트 래스터'에서 강조 표시됩니다. 하위 트레이스는 다양한 LFP 신호(다양한 모양에 유의) 및 개별 세포 외 EAP(빨간색 원)를 포함하여 확장된 시간 척도의 파형을 보여주는 상위 기록(빨간색 막대로 표시)의 epoch입니다. LFP/EAP 파형 및 극성은 이러한 신호를 생성하는 뉴런의 수, 기록 전극과의 근접성 및 주변 전극과의 상대적인 위치에 따라 달라집니다. 약어: MEA = microelectrode array; EAP = 세포외 활동 전위; LFP = 국소 자기장 전위; 4-AP = 4-아미노피리딘; TTX = 테트로도톡신.