쥐의 동맥 압력에 반응하여 신장 교감 신경 활동의 변화를 기록합니다.

초록

출처: Fink, A. M., et al. 마취된 쥐의 중추 신경계 조작에 대한 반응으로 신장 교감신경 활동의 급성 변화를 정량화합니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 쥐의 동맥압 변화에 반응하는 신장 교감 신경(RSN)의 활동을 연구하는 기술을 보여줍니다. 대퇴 동맥에 압력 감지 카테터를 부착하면 신장 교감 신경이 노출됩니다. 그런 다음 신경을 기록 전극 위로 들어 올리고 전기 활동을 기록합니다. 다음으로, 혈압을 높이기 위해 혈관 수축 약물을 주입하고 RSN 활성의 해당 변화를 모니터링합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 양극성 RSNA 전극 생성

1. 전극을 만들려면 각각 약 18mm 길이의 스테인리스 스틸 와이어 두 개를 자릅니다. 약 15mm 길이의 폴리에틸렌(PE-50) 튜브 한 개를 자릅니다. 두 개의 와이어 조각을 튜브에 넣고 와이어가 양쪽 끝에서 튀어나오도록 합니다.
2. 전선 끝에서 절연체를 제거하고 2-3mm의 노출된 전선을 남기고 전선을 다듬습니다. 한쪽 끝에서 노출된 와이어 위에 수 핀을 압착합니다. 핀을 와이어에 단단히 납땜하고 커넥터 스트립 내부에 핀을 고정한 다음 epoxy.
   로 연결을 덮습니다. 메모: 납땜을 피하는 또 다른 방법은 빠른 연결/해제 앨리게이터 클립을 사용하는 것입니다.
3. 전극의 반대쪽 끝에서 전선 끝에서 절연체를 제거하고 2-3mm의 노출된 전선을 남깁니다. 전선의 이 부분을 구부려 절연되지 않은 전선에 작은 "V"자 모양의 고리를 만듭니다.
   메모: 이것은 신장 교감 신경과 접촉할 전극의 일부입니다. 유체가 튜브에 들어가는 것을 방지하기 위해 이 끝을 밀봉하는 것이 중요합니다. 실리콘 또는 에폭시를 효과적으로 사용할 수 있습니다.

2. 마취 및 수술 부위 준비

1. 수컷 Sprague Dawley 쥐(생후 9-11주, 체중 150-400g)에게 마취를 투여합니다. 복강내(IP) 주사를 통해 펜토바르비탈 나트륨 50mg/kg을 투여합니다. 수술 중 안정적인 마취 평면을 평가하려면 15분마다 발가락 꼬집음 반사를 확인하고 필요에 따라 마취를 다시 투여합니다.
   메모: 펜토바르비탈 나트륨(Nembutal)은 RSNA의 조절을 방해하지 않고 지속적인 마취 평면을 달성하기 위해 이전 연구에서 사용되었습니다. 이 프로토콜은 비생존 수술을 위한 것이므로 회복/수술 후 모니터링 기간이 없습니다.
2. 기관의 동물 관리 지침에 따라 수술 부위를 준비합니다(예: 쥐의 복부, 등, 머리 면도, 10% 포비돈 요오드 용액으로 피부 세척, 눈 윤활제 바르기, 쥐를 발열 패드 위에 올려 놓기). 실험하는 동안 체온을 37°C로 유지합니다.

3. 평균 동맥압 모니터링을 위한 대퇴 동맥 캐뉼레이션

1. 현미경으로 동맥을 시각화합니다. 정맥 캐뉼레이션에 사용되는 방법과 유사하게, 동맥을 막기 위해 원위 봉합사를 묶습니다. 이 봉합사의 가장자리를 실크 테이프로 수술 부위에 고정하고 동맥을 외과 의사의 주로 사용하는 손에 수직으로 위치시킵니다.
2. 원격 측정을 사용하는 경우 동맥 접근
   1. 동맥 삽관을 삽입하기 전에 고배율로 압력 감지 카테터를 검사합니다. 카테터에 기포/파편이 없고 유체로 채워진(근위부) 구성 요소와 젤로 채워진(원위부) 구성 요소 사이에 손상되지 않은 반월판이 있는지 확인합니다. 각 이식 전에 카테터의 원위 끝에 젤을 다시 채웁니다. 자석을 사용하여 송신기를 켭니다. 완벽한 배치를 견디기 위해 수술 중 혈압(BP)을 모니터링하십시오.
   2. 근위 봉합사에 느슨한 오버핸드 반 매듭을 사용하여 대퇴 동맥을 잠시 폐색합니다. 주로 사용하지 않는 손으로 카테터 삽입기를 잡습니다. 끝에서 젤이 변위되지 않도록 혈관 캐뉼레이션 집게로 원격 측정 장치의 캐뉼라 끝을 잡습니다.
   3. 구부러진 22G 바늘로 동맥에 구멍을 뚫고 끝에서 젤이 변위되지 않도록 혈관 캐뉼레이션 집게를 사용하여 캐뉼라를 동맥에 삽입합니다. 캐뉼러를 가능한 한 멀리 전진시킵니다. 근위 및 원위 봉합사 타이를 사용하여 압력 카테터를 고정합니다.
   4. 원격 측정 임플란트의 몸체를 절개 부위에 인접한 옆구리 안쪽으로 밀어 넣고 절단 바늘에 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합합니다. 배터리 수명을 절약하기 위해 기록 기간이 끝나면 자석으로 원격 측정 장치를 끕니다.

4. 뇌에 접근하기 위해 정위 수술 프레임에 쥐를 배치합니다.

1. 쥐를 정위 수술 프레임의 엎드린 위치로 부드럽게 움직입니다.
2. 쥐를 이어바 사이에 놓고 앞니 막대를 조정하여 람다와 브레그마의 높이를 균등화합니다. 위치는 쥐의 균주, 체중 및 중추신경계(CNS) 표적의 위치에 따라 달라질 수 있습니다.
3. 두피의 정중선을 통해 2cm 길이의 꼬리 메스를 절개합니다. 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 두개골 표면에서 결합 조직을 단단히 제거합니다. 두개골에 과산화수소를 바르면 브레그마(bregma), 람다(lambda) 및 정중선 봉합사(midline sistures)를 시각화하는 데 도움이 됩니다.
4. 표적 지정을 안내하기 위해 쥐 뇌의 아틀라스를 사용하여 두개골을 통해 전극이 접근할 수 있는 크기의 버 구멍 절골술을 뚫습니다.

5. 신장 교감신경 분리

1. 와이어 RSNA 전극을 연결합니다(단계 1.1-1.3)를 10X 프리에 연결합니다.amp리퍼 및 미세 전극 amp리퍼
.
2. 후복막 절개를 통해 신장 신경을 격리하십시오., 쥐가 정위 골격에 고정되기 전이나 후에 말입니다. 쥐가 입위 프레임에 있을 때 RSNA 전극을 배치합니다. 갈비뼈 아래 4-5cm에서 꼬리 방향으로 척추 약간 옆으로 메스를 절개합니다. Blunt는 절개 부위를 절개하여 척추 주위 근육을 시각화합니다.
3. 가위를 사용하여 지방과 근육이 만나는 1-2cm의 매우 표면적인 꼬리 절개를 만듭니다. 솜 끝이 있는 어플리케이터를 사용하여 근육에서 지방을 멀리 퍼뜨려 신장을 시각화합니다. 복막 공간에 들어가지 않는 것이 중요합니다.
4. 견인기를 사용하여 신장과 척추 주위 근육을 부드럽게 분리하여 신장 동맥과 복부 대동맥을 시각화합니다. 신장 신경이 손상되지 않도록 혈관을 과도하게 늘리지 마십시오. 식염수에 적신 2" x 2" 면 거즈 패드를 사용하여 신장을 손상으로부터 보호하십시오.
5. 고배율에서 절개 주머니의 신장 신경을 확인합니다. 신경 다발은 대동맥과 신장 동맥에 의해 형성된 직각에서 가장 쉽게 볼 수 있습니다. 신장 신경은 대동맥에서 신장까지 신장 동맥을 밀접하게 따릅니다.
6. 기록 전극에 배치할 신경 다발의 일부를 선택합니다. 미세 절제 핀셋을 사용하여 주변 조직/혈관에서 신경 섬유를 부드럽게 절개합니다.
7. 와이어 RSNA 전극을 홀더에 고정합니다(예: 지지 스탠드에 부착된 앨리게이터 클립). 전극을 신경 분절 수준까지 내립니다. 신경 후크를 사용하여 신경을 늘리지 않고 신장 신경의 부분을 전극 위로 부드럽게 들어 올립니다.
   메모: 신경은 신경과 평행하게 절연되지 않은 전선의 두 "V"자 모양의 고리 안에 있어야 합니다. 전극선은 다른 조직, 혈액 또는 림프액에 닿지 않아야 합니다.
8. 노출된 신장 교감 신경이 건조해지는 것을 방지하기 위해 절개 부위에 미네랄 오일을 채웁니다. 한쪽 끝은 절개 부위 피부에 닿고 다른 쪽 끝은 패러데이 케이지에 부착된 접지 클립을 사용합니다.
9. 고역 통과 및 저역 통과 필터링(10Hz 및 3kHz)을 사용하여 신호를 증폭기로 보냅니다. 게인을 최대 10K까지 조정합니다. RSNA의 버스팅 패턴을 평가하기 위한 오디오 모니터를 포함합니다. 2,000-10,000Hz 범위의 샘플링 속도를 사용합니다. CNS 조작이 빠르거나 짧은 교감신경 반응을 유발한다는 가정이 있는 경우 증가된 샘플링 속도를 사용합니다.

6. 레코드 데이터

1. 식염수 1mL 또는 10μg/mL 페닐에프린(0.1mL) 정맥 주사로 압력반사를 유발하여 RSNA 기록의 품질을 평가합니다. 그림 1에서 볼 수 있듯이 주입은 혈압을 증가시키고 RSNA를 억제해야 합니다. 평균 동맥압이 60-80mmHg의 증가는 신장 교감신경 억제에 충분합니다.
2. 필요한 경우 전극의 위치를 조정하여 신호를 개선합니다. 신경이 전극의 두 고리와 접촉하지 않거나 조직, 혈액 또는 림프액이 와이어와 접촉하는 경우 재배치가 필요합니다.
   메모: 재배치의 필요성은 신경 방전의 청각적 특성에 따라 결정됩니다.
3. 명확한 신호가 확인되면 미네랄 오일을 빼내고 실리카겔을 발라 절개 주머니의 신경/전극 연결을 덮어 RSNA 전극을 제자리에 고정합니다. 젤이 완전히 굳기 전에 쥐를 움직이지 마십시오.
4. RSNA 및 평균 동맥압을 지속적으로 기록하면서 CNS 조작 프로토콜을 수행합니다. 마이크로인젝터/펄서가 뇌간 조작에 사용되는 경우, 이 장치의 로직 신호를 RSNA/BP 기록에 도입하여 CNS 조작 타이밍을 문서화할 수 있습니다.
5. 실험이 완료되면 실리카겔과 척추 근육 사이의 기록 전극에 근접한 신경을 분쇄하여 소음 수준을 결정합니다. RSNA에 대해 이 "0" 값을 30초 이상 기록합니다. 소음을 정량화하기 위한 대안적인 접근법으로, 아트로핀, 헥사메토늄, 클로리소다민 또는 펜톨리늄 타르타르산염과 같은 속효성 신경절 차단제를 투여합니다.
6. RSNA 전극을 조심스럽게 제거하고 와이어 전극에서 실리카겔의 흔적을 제거합니다. 재사용을 위해 전극을 보관하십시오. 텔레메트리 송신기를 끄고 카테터 끝이 손상되지 않도록 주의하면서 제거합니다.

결과

그림 1: 페닐에프린 주사 IV에 대한 반응의 RSNA 및 BP.원시 RSNA(A)는 전파 정류(B)되었습니다. 정류된 파쇄된 "제로" RSNA는 삽입 C에 표시됩니다. 겹치지 않는 10초 평균(노이즈 마이너스)을 계산했습니다(D). 압력반사를 유발하기 위해 0.1mL의 페닐에프린(1μg/mL)을 정맥 주사(화살표)로 주입했습니다. 볼루스 주입은 혈압의 갑작스러운 증가와 RSNA의 일시적인 억제를 이끌어냈습니다. pedunculopontine tegmentum은 Nembutal-마취된 쥐의 신장 교감신경 활동과 심폐 활동을 제어합니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스테인레스 스틸 와이어	AM 시스템; 세큄, 워싱턴	791000	RSNA 전극
폴리에틸렌(PE-50) 튜빙	폭스바겐; 래드너, 펜실베이니아	63019-048	RSNA 전극; 혈관 캐뉼레이션
미니어처 핀 커넥터	AM 시스템; 세큄, 워싱턴	520200	RSNA 전극
압착 공구	다니엘스 제조 공사; 올랜도, 플로리다	M22520	RSNA 전극
커넥터 스트립	암페놀; 클린턴 타운십, 미시간	Tel.221-2653	RSNA 전극
J-B 퀵 에폭시	JB 용접, 설퍼 스프링스, 텍사스	8270	RSNA 전극
실리콘	퍼마텍스; 하트퍼드, 코네티컷	2222	RSNA 전극
헤파린 나트륨; 주사제(10mL 바이알, 1000U/mL)	KV 수의학 공급; 데이비드 시티, 네브래스카	P03466	정맥 라인 개통
페닐 에프린 HCl; 주사용 가능(1mL 바이알, 10mg/mL)	ACE 외과 공급; 매사추세츠주 브록턴	전화: 950-6312	신장 교감신경 억제 검사
단일 후크 탄성 수술 스테이	하버드 장치; 매사추세츠주 홀리스턴	우편번호 72-2595	베기
실크 수술용 테이프	3M, 미니애폴리스, 미네소타	1538-0	안전한 수술 입원
바늘, 20g	시그마-알드리치; 미주리주 세인트루이스	Z192554-100개	선박 캐뉼레이션
Dumont #7 곡선 집게	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	11274-20	선박 캐뉼레이션
5-0 실크 봉합사 넥타이	브레인트리 사이언티픽; 브레인트리, 매사추세츠	SUT-S 106	선박 캐뉼레이션
섬세한 지혈 겸자	Roboz 수술 기구 Co.; 게이더스버그, 메릴랜드	RS-7117	혈관 삽관 및 RSNA 수술
Crile 지혈 겸자	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	13004-14	바늘 굽힘
텔레메트리 송신기	데이터 사이언스 인터내셔널; 미니애폴리스, 미네소타	펜실바니아 -10	평균 동맥압 모니터링(원격 측정)
리젤 주사기	데이터 사이언스 인터내셔널; 미니애폴리스, 미네소타	Tel.: 276-0038-001	송신기 재사용(원격 측정)
일회용 압력 변환기	트랜스팩; 샌 클레멘테, 캘리포니아	미-1224	평균 동맥압 모니터링
클리어 커프 압력 주입기	MILA 인터내셔널 Inc.; 피렌체, 켄터키	2281339	평균 동맥압 모니터링
혈관 캐뉼레이션 겸자	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	제00574-11	카테터 삽입
블랙 모노필라멘트 나일론 4-0 봉합사 리버스 커팅 니들	McKesson 의료-외과; 샌프란시스코, 캘리포니아	S661GX〈그레이	보안 텔레메트리 송신기
텔레메트리 수신기	데이터 사이언스 인터내셔널; 미니애폴리스, 미네소타	RPC-1	평균 동맥압 모니터링(원격 측정)
LabChart Pro(소프트웨어), PowerLab(수집 하드웨어)	광고 기기; 콜로라도 스프링스, 콜로라도	ML846, MX2 매트릭스 2.0(Data Science International 텔레메트리와 호환)	소프트웨어/수집 하드웨어를 위한 3가지 옵션
SciWorks(소프트웨어), DataWave(수집 하드웨어)	DataWave Technologies, 콜로라도주 러브랜드	해당 사항 없음
스파이크 2(소프트웨어), Micro1401-3	Cambridge Electronic Design Ltd., 영국 런던	1401-3
마이크로 드릴	Roboz 수술 기구 Co.; 게이더스버그, 메릴랜드	RS-6300	중추신경계 수술
정위 수술 프레임	도둑질; 우드 데일, 일리노이	51600	중추신경계 수술
10X 프리앰프가 있는 미세전극 앰프	AM 시스템; 세큄, 워싱턴	1800-2	RSNA 레코딩
견인기	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	17009-07	RSNA 레코딩
미세 해부 핀셋	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	11251-10	RSNA 레코딩
마이크로 훅	훌륭한 과학 도구; 포스터 시티, 캘리포니아	10064-14	RSNA 레코딩
미네랄 오일	피셔 사이언티픽; 월섬, 매사추세츠	8042-47-5	RSNA 레코딩
오디오 모니터	AM 시스템; 세큄, 워싱턴	3300	RSNA 레코딩
실리카겔	바커, 뮌헨; 독일	RT601A-B	RSNA 레코딩
전기 클립	타이코 전자; 샤프하우젠, 스위스	EB0283-000	관류 바늘 접지 또는 고정
본 가위, 직선 / 날카로운 점	Roboz 수술 기구 Co; 게이더스버그, 메릴랜드	RS-5840	관류
개비젼	하버드 장치; 매사추세츠주 홀리스턴	Tel.: 75-0286	관류
Masterflex 관류 펌프	콜-파머; 버논 힐스, 일리노이	7524-10	관류
Masterflex 백금 경화 실리콘 튜빙	콜-파머; 버논 힐스, 일리노이	96410-15	관류
포르말린(10% 완충 용액, 4L)	시그마-알드리치; 미주리주 세인트루이스	HT501128	관류
자당	시그마-알드리치; 미주리주 세인트루이스	S0389	크라이오 프로텍션