생쥐 뇌 슬라이스에서 재프로그래밍된 뉴런의 전기생리학적 기록

초록

출처: Pereira, M., et al. 바이러스 벡터의 뇌내 주입에 의한 상주 신경교세포를 인터뉴런으로 직접 재프로그래밍. J. Vis. 특급 (2019)

이 비디오는 형질주입된 마우스 선조체 절편에서 신경교세포의 뉴런으로의 성숙 및 재프로그래밍을 평가하는 프로토콜을 보여줍니다. 이 실험은 뉴런 특이적 형광 마커와 전기 생리학 기술을 사용하여 휴지막 전위와 전류 주입에 대한 반응을 측정합니다. 이러한 측정 중 전압 스파이크는 성공적인 뉴런 성숙 및 재프로그래밍을 나타냅니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 전체 셀 패치 클램프 기록

1. 첫 번째 조직 절편을 Krebs 용액의 연속적인 흐름에 잠긴 기록 챔버로 옮깁니다. 가벼운 무게를 사용하여 섹션을 장착하고 대물렌즈를 물에 담그십시오.
2. 현미경에서 선조체 영역을 식별하고 GFP 양성(재프로그래밍된) 뉴런을 검색합니다. 형태학적으로 광범위하고 섬유 다발이나 혈관으로 덮여 있지 않은 뉴런을 선택하십시오.
3. 패치를 위해 붕규산 유리 피펫(3–7 MΩ)을 준비하고 세포 내 용액(mM)으로 채웁니다: 122.5 글루콘산칼륨, 12.5 KCl, 0.2 EGTA, 10 HEPES, 2 MgATP, 0.3 Na₃GTP 및 8 NaCl, KOH로 pH 7.3으로 조정.
4. 유리 피펫을 기록 전극에 부착하고 용액에 담그십시오. 전극의 저항을 다시 확인하십시오. 그런 다음 피펫으로 셀에 천천히 접근하고 팁이 막히지 않도록 전극에 약간의 양압을 유지합니다.
   주의: 전극을 내려가는 동안 세포를 추적하고 세포의 형광을 표백하지 않도록 주의하십시오(즉, 형광 램프가 필요하지 않을 때 형광을 끄십시오).
5. 전극의 양압을 사용하여 주변 조직을 조심스럽게 헹구고 전극으로 세포에 접근합니다. 세포 바로 위에 전극을 배치하고 전극이 멤브레인에 닿을 때까지 하강합니다. 전극과 세포막 사이에 기가Ω 밀봉을 만들고 음압 펄스로 세포막을 파열하여 전체 세포 패치를 만듭니다.
   주의: 재프로그래밍된 뉴런은 민감합니다. 패치를 붙일 때 주의하고 Giga-Ω 씰에 도달하거나 세포막을 열 때 너무 많은 음압을 가하지 마십시오. 또한 나이가 많은 동물에게 패치를 붙이려면 결합 조직이 두꺼워지고 뉴런을 시각화하기가 더 어렵기 때문에 연습과 인내가 필요합니다.
6. 전류 클램프 모드에서 침입한 직후 휴지 멤브레인 전위를 확인하고 분석을 위해 기록해 두십시오.
7. 전류 클램프에서 셀을 -60mV에서 -80mV 사이로 유지하고 -20pA에서 +90pA까지 500ms 전류를 10pA 단위로 주입하여 활동 전위를 유도합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마-알드리치	S3014
케이클	시그마-알드리치	P9333
NaH2PO4-H 2O	시그마-알드리치	S9638
마그네슘2-6 H2O	시그마-알드리치	M2670
칼슘2-6 H2O	시그마-알드리치	C8106
마그네슘4-7 H2O	시그마-알드리치	230391
나HCO3	시그마-알드리치	S5761
포도당	시그마-알드리치	G7021
코	시그마-알드리치	P5958-500G
K-D-글루코네이트	시그마-알드리치	G4500 시그마
케이클	시그마-알드리치	P9541
KOH-EGTA (에틸렌 글리콜 -비스-N- 테 트레이 트산)	시그마-알드리치	E3889 시그마
KOH- 헤페스 산 (N-2- 히드 록시 에틸 피페 라진 -N'-2- 에탄 술폰산)	시그마-알드리치	H7523
염화나트륨	시그마-알드리치	S3014
마그네슘2ATP	시그마-알드리치	A9187
나3GTP	시그마-알드리치	G8877
얼음
붕규산 유리 피펫	서터 컴퍼니	나150-86-10
유리 모세관 풀러	Sutter 회사	P-1000
물목욕	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	TSGP02
Clampfit 소프트웨어	분자 장치