신경 활동을 이미지화하기 위해 형질전환 마우스의 뇌에 광학 창 설치

초록

출처: Lin, X., et al. Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 형질전환 마우스의 광학 창을 통해 뇌의 신경 활동을 기록하는 것을 보여줍니다. 쥐는 신경 활동을 감지할 수 있는 형광 단백질을 발현합니다. 두개골의 작은 부분을 조심스럽게 제거하여 광학 창을 설치하고, 두개골을 검은색 시멘트로 덮어 이미징 전에 빛을 차단합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이미징을 위한 동물 준비

1. 멸균 거즈, 면봉 및 오토클레이브 수술 도구를 수술 부위에 놓습니다. 수술 도구의 수술 간 멸균을 위해 Micro Bead Sterilizer를 켭니다.
2. 케타민(17.2mg/mL), 자일라진(0.475mg/mL) 및 아세프로마진(0.238mg/mL)(체중 6μL/g)의 혼합물을 복강내 주사(ip)하여 마우스(남성 또는 여성, 1.5-2.5개월, 20-25g)를 마취합니다. 동물이 발가락 꼬집음 자극에 반응을 멈추고 각막 반사가 없을 때 적절한 마취 깊이에 도달할 때까지 기다립니다. 수술 중에는 원래 마취 상태를 유지하기 위해 필요에 따라 원래 마취 칵테일 용량의 1/3을 추가 용량으로 투
여합니다.
3. 수술 전에 진통제로 부프레노르핀을 피하주사(s.c.; 0.05–0.10 mg/kg)합니다. 각막 건조와 백내장 형성을 방지하기 위해 동물의 눈에 보호 연고를 바르십시오.
4. GCaMP6s 형질전환 마우스를 저체온증을 방지하기 위해 발열 패드에 놓고 멸균 수술용 드레이프로 덮습니다. 생쥐용 헤드 홀딩 어댑터(Head Holding Adaptor for Mice)로 동물의 머리를 안정시킵니다.
5. 양날 면도날로 두피 대부분을 머리로 깎습니다. 멸균 알코올 준비 패드로 수술 부위를 청소한 다음 포비돈 요오드 용액을 사용합니다.

2. 만성 두개골 창 준비

두개골의
1. 한쪽(오른쪽)에 가위로 두피(2mm x 3mm)를 직사각형으로 자릅니다. 면봉으로 피부를 옆으로 밀어 직경 >3mm의 노출 영역을 만듭니다(그림 1A). 뭉툭한 미세수술 칼날(Scalpel Blade #10; 그림 1C).
2. 치과용 드릴을 사용하여 두개골에 원(직경 3mm, 중심 좌표: 브레그마에서 -1.5mm, 정중선에서 2.5mm)을 부드럽게 그려 S1 영역을 표시합니다(그림 2B).
3. 왼쪽 두개골에 대해서도 동일한 절차를 수행합니다(그림 2B).
4. 치아 시멘트 적용을 위한 기초를 제공하기 위해 뼈에 Cyanoacrylate Super Glue를 얇게 바르십시오.
5. 해부 현미경으로 고속 마이크로드릴을 사용하여 S1 부위 주위의 두개골에 있는 원형 홈을 얇게 만듭니다(그림 1D). 목적은 광학 창을 배치하기 위한 부드러운 가장자리를 만드는 것입니다.
6. 얇아지는 과정에서 인공 뇌척수액(ACSF, 실온)을 주기적으로 두개골에 반복적으로 도포하여 드릴링을 용이하게 하고 열을 발산합니다. 마찰로 인한 과열을 방지하기 위해 드릴링을 간헐적으로 수행하십시오. 집 진공 라인이나 진공 펌프로 뼈 찌꺼기를 빨아들입니다.
7. 뼈의 약 2/3 깊이를 뚫은 후 두개골의 원형 조각(뼈 피판)이 주변 두개골에서 완전히 제거될 때까지 나머지 1/3 뼈를 천천히 조심스럽게 얇게 만듭니다.
8. 한 쌍의 # 5/45 집게로 원형 뼈 피판을 천천히 조심스럽게 제거하고 경막을 노출시킵니다(그림 2C; 그림 1E).
9. ACSF로 노출된 뇌 부위를 촉촉하게 유지하십시오(그림 1E). 출혈은 뇌 혈류를 변화시키고 뇌 부종을 가속화하며 영상 품질을 심각하게 저하시키므로 혈관의 손상을 피하십시오.
10. 두개골의 왼쪽(반대쪽)에도 동일한 절차를 수행합니다.
11. 광학 창을 조립하려면 광학 접착제를 사용하여 커버 글라스 층 사이를 한 번에 하나씩 접착하고 경화하십시오. 필요한 경우 인큐베이터에서 광학 창(50시간 동안 12°C)을 예열하여 접착 결합을 향상시킵니다. 광학 창은 2부분으로 구성됩니다: 상단 부분에는 직경 5mm의 단일 원형 커버 유리가 있고 하단 부분에는 직경 3mm의 1-3개의 원형 커버 유리가 있습니다(그림 2D).
12. 광학 창을 에탄올(70%, vol/vol)에 보관하고 사용하기 전에 멸균 식염수로 헹굽니다. 광학 창을 설치하기 전에 광학 창에 잘못된 양의 광학 접착제 또는 입체경 아래의 부정확한 정렬을 포함한 결함이 있는지 확인하십시오.
13. 개두술 부위에 광학 창을 설치합니다(그림 2D). 광학 창의 상단 부분은 두개골 위에 놓이고, 광학 창의 하단 부분은 두개골 절개구 내에 맞고 CSF가 있는 상태에서 경막에 놓입니다(그림 2D, E).
14. 광학 창 가장자리의 상단 부분을 Cyanoacrylate Super Glue로 두개골에 밀봉합니다(그림 2F; 그림 1F).
15. 시아노아크릴레이트 슈퍼 글루가 마르면 검은색 치과용 시멘트(Dentsply)를 바르고 유리 가장자리를 덮습니다. 빛을 차단하기 위해 노출된 모든 두개골과 상처 가장자리에 치과용 시멘트를 바르십시오(그림 2G-H; 그림 1B).
16. 왼쪽에서도 동일한 절차를 수행합니다.
17. 동물이 가열 패드에서 회복할 수 있도록 하고 적절한 모니터링 하에 회복을 위해 동물을 집 우리로 되돌려 보냅니다. 씹고 수분을 공급하기 위해 습식 사료를 제공하십시오. 통증을 줄이기 위해 부상 후 8-12시간마다 2일 동안 부프레노르핀 s.c.(0.05–2.0mg/kg)를 투여합니다. 이미징하기 전에 추가로 7-10일 동안 마우스가 회복할 때까지 기다립니다.

결과

그림 1. 두개골에 양측 창을 만듭니다. (A) 사진 이미지는 S1 영역 위에 있는 두개골의 각 측면에 있는 2개의 두개골 광학 창을 보여줍니다. (B) 이미지의 박스형 영역의 고배율 (A) 기저 경막과 혈관을 노출시키는 양측 광학 창을 보여줍니다. 스케일 바 = 680μm. (C) 노출된 두개골. (D) 중앙 뼈 피판이 보이는 원형 홈의 생성. 스케일 바 = 900μm. (E) 뼈 피판을 제거한 후 두개골 개구부를 인공 뇌척수액(ACSF)으로 채웠습니다. 스케일 바 = 720 μm. (F) 두개골 개구부에 광학 창을 설치하고 창 가장자리를 슈퍼 접착제로 밀봉합니다. 경막과 혈관은 광학 창을 통해 볼 수 있습니다. 스케일 바 = 600μm.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J-TG(Thy1-GCaMP6s)GP4.3DKIM/J	잭슨	24275	흥분성 뉴런의 부분 집합에서 녹색 형광 칼슘 지표인 GCaMP를 발현하는 유전적으로 암호화된 뉴런 지표 및 효과기에 의해 만들어진 모든 균주일 수 있습니다.
나6. Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ입니다.	잭슨	7919	피질의 특정 집단 내에 있는 뉴런의 부분 집합에서 EGFP를 발현하는 모든 균주가 될 수 있으며, 밝고 생명력 있는 Golgi 같은 염색을 제공합니다.
Dumont no. 5 겸자, 스탠다드, Dumoxel	정밀 과학 도구	11251-30	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
Dumont no. 5 SF집게	정밀 과학 도구	11252-00	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
마이크로 비드 살균기	남부 실험기구	B1201	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
Harishige의 SG-4N 헤드 홀딩 어댑터	트라이텍 연구	SG-4N	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
이상적인 마이크로 드릴 전체 키트	하버드 기구	Tel.: 72-6065	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
마이크로 드릴용 버	정밀 과학 도구	19007-05	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
원형 커버 유리, 3mm	하버드 생명과학	파4 64-0720	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
원형 커버 유리, 5mm	하버드 생명과학	파4 64-0700	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
Norland 광학 접착제	노랜드 프로덕츠	7106	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
록타이트 액체 슈퍼 접착제	WB 메이슨	LOC1647358	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
그립 시멘트 키트, 분말 및 용제	덴스플라이	675570	원하는 브랜드가 될 수 있습니다. 흰색 치과용 시멘트 분말(그립 시멘트) 5부와 검은색 템페라 분말 페인트 1부를 혼합합니다(빛을 차단하기 위해, 일부 사용자는 10:1 비율을 선호함).
젤 폼	무어 메디컬	2928	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
마이크로 해부 가위	로보즈	RS-5841	원하는 브랜드가 될 수 있습니다.
인공 뇌척수액(ASF)	-	-	ACSF는 125mM NaCl, 4.5mM KCl, 26mM NaHCO3, 1.25mM NaH2PO4, 2mM CaCl2, 1mM MgCl2 및 20mM 포도당을 포함합니다. ACSF에 산소(산소 95%, 이산화탄소 5%)를 거품을 일으키고 pH를 7.4로 조정합니다. 모든 실험 전에 새로운 ACSF 용액을 준비합니다.

피질의 년 년 년 년 년 년