척수 절편의 실질체 젤라티노사 뉴런에서 기록하는 전체 세포 패치 클램프

초록

출처: Zhu, M., et al. substantia gelatinosa neurons에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 위한 급성 척수 절편의 준비. J. Vis. 특급 (2019년)

이 비디오는 뉴런 발화 패턴을 분석하기 위해 전체 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 척수 절편의 SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전기생리학적 기록을 수행하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 척수의 SG 뉴런의 자극에 대한 신경 반응을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 용액 및 재료 준비

1. 솔루션
   1. 인공 뇌척수액(ACSF) 준비(mM): 117 염화나트륨(NaCl), 3.6 염화칼륨(KCl), 1.2 인산이수소나트륨(NaH₂PO₄·2H₂O), 2.5 염화칼슘 이수화물(CaCl₂·2H₂O), 1.2 염화마그네슘 육수화물(MgCl₂·6H₂O), 25 중탄산나트륨(NaHCO₃), 11 D-포도당, 0.4 아스코르브산, 및 2 나트륨 피루 베이트. 표 1을 참조하십시오.
   2. K⁺ 기반 세포 내 용액 준비(mM): 130 K-글루코네이트, 5 KCl, 10 Na₂-포스포크레아틴, 0.5 에틸렌 글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA), 10 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES), 4 마그네슘 아데노신 삼인산(Mg-ATP) 및 0.3 리튬 구아노신 삼인산(Li-GTP). 표 2를 참조하십시오.
   3. 세슘(Cs⁺) 기반 세포 내 용액 준비(mM): 92 세슘 메탄 설포네이트(CsMeSO₄), 43 염화세슘(CsCl), 10 Na₂-포스포크레아틴, 5 테트라에틸암모늄(TEA)-Cl, 0.5 EGTA, 10 HEPES, 4 Mg-ATP 및 0.3 Li-GTP. 표 3.
      참조 메모: 모든 용액은 증류수를 사용하여 준비해야 합니다. ACSF 및 수크로오스-ACSF는 약 7.4의 최적 pH를 유지하기 위해 사용 전에 발암(95%_O2 및 5% CO₂ 혼합물)해야 하며, 이 두 용액의 삼투압은 300–310 밀리오스몰(mOsm)로 조정해야 합니다. 아스코르브산은 칼슘 채널에 영향을 줄 수 있기 때문에 칼슘 전류를 기록하려면 이 약제를 생략해야 합니다. 세포 내 용액의 삼투압과 pH를 측정하고 각각 290–300mOsm 및 7.2–7.3으로 조정해야 합니다. 0.2μm 필터로 세포 내 용액을 여과하고 -20°C에서 1mL 분취량으로 용액을 보관하는 것이 좋습니다. Cs⁺ 및 TEA는 Cs⁺ 기반 세포 내 용액에 적용되어 칼륨 채널을 차단하며, 이는 억제성 시냅스후 전류(IPSC)를 기록할 때 증폭기를 사용하여 멤브레인 전위를 0mV로 일정하게 유지하는 데 도움이 됩니다.
2. 악기
   1. 일반적인 전기생리학 시스템의 경우 적외선 미분 간섭 대비(IR-DIC)와 고해상도 침수 대물렌즈, CCD/CMOS 카메라, 패치 클램프 증폭기, 마이크로 피펫 홀더 및 피펫 위치를 미세 조정할 수 있는 마이크로 매니퓰레이터가 장착된 정립 현미경을 사용하십시오. 현미경을 이동하려면 XY 스테이지도 필요합니다.
   2. 패러데이 케이지로 둘러싸인 방진 테이블에 모든 장비를 장착합니다. 비디오 모니터를 비디오 카메라에 연결하여 뉴런을 관찰하고 마이크로피펫을 시각화합니다.
3. 마이크로피펫
   1. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관의 전극을 기록합니다. 일반적인 피펫 저항 범위는 세포 내 용액으로 충전될 때 3-6 MΩ입니다.

2. 전체 셀 패치 클램프 녹음

1. SG(substantia gelatinosa) 뉴런에서 전체 세포 패치 클램프 기록을 수행하려면 대부분의 기록 사례에 K⁺ 기반 세포 내 솔루션을 사용하고 억제성 시냅스 후 전류의 기록에만 Cs⁺ 기반 솔루션을 적용합니다.
2. 척수 슬라이스를 녹음 챔버로 부드럽게 옮긴 다음 최적의 슬라이스 안정성을 위해 나일론 실로 연결된 U자형 백금 와이어로 단단히 유지하십시오. 중력 시스템을 통해 RT에서 기포된 ACSF로 슬라이스를 꾸준히 관류하고 충분한 산소화를 달성하기 위해 관류 속도를 2–4mL/분으로 설정합니다.
3. 저해상도 현미경 렌즈를 사용하여 SG(반투명 밴드) 영역을 확인하고, 고해상도 대물렌즈를 표적 세포로 사용하여 건강한 뉴런을 선택하고, 이를 비디오 모니터 화면의 중앙으로 조정합니다.
4. 필요에 따라 적절한 양의 K⁺ 기반 또는 Cs⁺ 기반 세포 내 용액으로 마이크로피펫을 채우고, 마이크로피펫을 전극 홀더에 삽입하고, 세포 내 용액이 홀더 내부의 은선과 접촉하는지 확인합니다.
5. 마이크로피펫에 초점을 맞추고 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 ACSF에 담근 다음 약한 양압(압력계로 측정 시 ~1psi)을 가하여 마이크로피펫을 먼지와 부스러기로부터 멀리 떨어뜨립니다.
6. 마이크로피펫을 표적 뉴런 쪽으로 점차적으로 움직입니다. 피펫이 뉴런에 접근하면 양압을 해제하고 뉴런 막에 매우 작은 딤플이 형성되어 기가씰을 형성합니다.
7. 포전위를 세포의 생리적 휴지막 전위(RMP)에 가까운 -70mV로 변경합니다. 그런 다음 마이크로피펫에 일시적인 부드러운 흡입을 가하여 멤브레인을 파열하고 양호한 전체 세포 구성을 만듭니다.
   메모: 슬라이스를 기록 챔버로 옮긴 후 최소 5분 동안 꾸준한 관류를 유지하여 슬라이스 표면의 이물질을 제거합니다. 건강한 뉴런과 건강하지 않은/죽은 뉴런을 구별하는 능력은 양호한 밀봉과 안정적인 기록을 위해 가장 중요하다는 점에 주목할 가치가 있습니다. 건강하지 않거나 죽은 뉴런은 눈에 보이는 큰 핵과 함께 부풀어 오르거나 쭈글쭈글한 모양을 가지고 있는 반면, 건강한 뉴런은 밝고 매끄러운 막이 있는 3차원(3D) 모양이 특징이며 핵은 보이지 않습니다. 전체 셀 구성을 달성하려면 필요한 경우 빠르거나 느린 커패시턴스를 단계별로 보상하는 것이 필수적입니다. 실온(RT)에서 액체 접합 전위는 K⁺ 기반 및 Cs⁺ 기반 세포 내 용액에서 각각 15.1–15.2mV 및 4.3–4.4mV로 계산됩니다. 우리의 연구에서 기록된 데이터는 액체 접합 전위에 대해 보정되지 않았습니다.
8. 본질적인 막(intrinsic membrane) 특성의 기록
   1. 기록적인 발화 특성: RMP에서 일련의 1초 탈분극 전류 펄스(25pA 증가, 25–150피코암페어(pA))로 전류 클램프에서 각 뉴런의 발화 패턴을 테스트합니다. 오프라인에서 단일 활동 전위의 임계값, 진폭 및 절반 너비를 측정합니다.

표 1: ACSF 레시피

의 분 호 의 호 의 호 호 의 의 분 의 세 호 년 의 개

구성 요소	분자량	농도 (mM)	g/L
염화나트륨	58.5	117	6.84
케이클	74.5	3.6	0.27
나H2PO4·2H2O	156	1.2	0.19
염화나트륨2·2H2O	147	2.5	0.37
마그네슘Cl2·6H2O	203	1.2	0.24
나HCO3	84	25	2.1
D-포도당	180	11	1.98
아스코르브산	198.11	0.4	0.08
나트륨 피루브산	110	2	0.22

표 2: K⁺ 기반 세포 내 용액 레시피

년 의 개 분 분 분 분 분 일 명 분 년 명 개 월 분

구성 요소	분자량	농도 (mM)	mg/100mL
K-글루코네이트	234.2	130	3044.6
케이클	74.5	5	37.28
Na2-포스포크레아틴	453.38	10	453.38
에그타	380.35	0.5	19월 2
헤페스	238.31	10	238.3
마그네슘-ATP	507.18	4	202.9
재질 보기 Li-GTP	523.18	0.3	15.7

표 3: Cs⁺ 기반 세포 내 용액 레시피

의 분 월 표시기 분 의 분 분 분 분 명 개 분 분 일 명 분 년 명 개 월 분

구성 요소	분자량	농도 (mM)	mg/100mL
CSM메SO4	228	92	2097년 6
증권 시세	168.36	43	723.95
Na2-포스포크레아틴	453.38	10	453.38
차 -Cl	165.71	5	82.86
에그타	380.35	0.5	19월 2
헤페스	238.31	10	238.3
마그네슘-ATP	507.18	4	202.9
재질 보기 Li-GTP	523.18	0.3	15.7

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
염화나트륨	시그마	S7653	ACSF 및 PBS의 제조에 사용
케이클	시그마	60130	ACSF, 자당-ACSF 및 K+ 기반 세포 내 용액의 제조에 사용됩니다.
나H2PO4·2H2O	시그마	71500	ACSF, 자당-ACSF 및 PBS의 제조에 사용
염화나트륨2·2H2O	시그마	C5080	ACSF 및 자당-ACSF의 제조에 사용
마그네슘Cl2·6H2O	시그마	M2670	ACSF 및 자당-ACSF의 제조에 사용
나HCO3	시그마	S5761	ACSF 및 자당-ACSF의 제조에 사용
D-포도당	시그마	G7021	ACSF 제조에 사용
아스코르브산	시그마	P5280	ACSF 및 자당-ACSF의 제조에 사용
나트륨 피루브산	시그마	A7631	ACSF 및 자당-ACSF의 제조에 사용
자당	시그마	S7903	자당-ACSF의 제조에 사용
K-글루코네이트	와코	Tel.: 169-11835	K+ 기반 세포 내 용액의 제조에 사용
Na2-포스포크레아틴	시그마	P1937	세포내 용액의 제조에 사용
에그타	시그마	E3889	세포내 용액의 제조에 사용
헤페스	시그마	H4034	세포내 용액의 제조에 사용
마그네슘-ATP	시그마	A9187	세포내 용액의 제조에 사용
재질 보기 Li-GTP	시그마	G5884	세포내 용액의 제조에 사용
CSM메SO4	시그마	C1426 (영문	Cs+ 기반 세포 내 용액의 준비에 사용
증권 시세	시그마	C3011	Cs+ 기반 세포 내 용액의 준비에 사용
차 -Cl	시그마	T2265	Cs+ 기반 세포 내 용액의 준비에 사용
나2HPO4	Hengxing 화학 시약		PBS 제조에 사용
붕규산 유리 모세관	세계적인 정밀 기기	TW150F-4	1.5mm 외경, 1.12mm 내경
마이크로피펫 풀러	셔터 계기	P-97	마이크로피펫 제조에 사용
적외선 CCD 카메라	다게-MIT	IR-1000
패치 클램프 증폭기	헤카	EPC-10
마이크로 매니퓰레이터	셔터 계기	MP-285
X-Y 스테이지	버레이	지브롤터 X-Y
정립 현미경	올림푸스	BX51WI
삼투압계	고급	피스케 210
PH 측정기	메틀러 톨레도	FE20

년 (영문) (영어) ) 표시기 시리즈 (영문) 시리즈 시리즈