Multi-Shank Linear Silicon Probes를 사용하여 행동하는 마우스의 뇌 전기 활동 기록

Abstract

출처: Sauer, J., et al. 행동하는 생쥐의 해마에서 공간적으로 제한된 진동 기록. J. vis. 특급 (2018).

이 비디오는 국소 자기장 전위를 측정하기 위해 다중 생크 선형 실리콘 프로브를 마우스 뇌에 이식하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 프로브를 입체 장치에 고정하고, 표적 뇌 영역에 정확하게 배치하고, 뇌에 삽입하고, 치과 시멘트로 고정하는 것이 포함됩니다. 이식 후 어셈블리는 케이스로 보호됩니다. 회복 후 이 설정을 통해 국소 자기장 전위를 기록하여 뉴런 활동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Protocol

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 준비

사항

1. 주입 과정에서 실리콘 프로브와 전극 커넥터를 임시로 운반하는 적절한 삽입 도구를 설계하고 구축합니다. 그림 1에서 사용자 정의 built-built 삽입 도구의 예를 참조하십시오.
2. 세라믹 팁 집게를 사용하여 포장에서 실리콘 프로브와 전극 커넥터를 조심스럽게 분리합니다.
3. 커넥터 보드를 들어 올리고 스탠드에 부착된 악어 cl로 단단히 고정합니다.
4. 입체경을 사용하여 세라믹 팁 집게가 있는 삽입 도구와 프로브를 정렬합니다. 소작기로 녹인 ~2mm의 파라핀 왁스 층을 적용하여 프로브를 삽입 도구에 붙입니다. 이 절차를 수행하는 동안 프로브 섕크를 만지지 않도록 주의하십시오.
5. 표준 접착 테이프를 사용하여 전극 커넥터를 삽입 도구의 샤프트에 고정합니다. 제조업체에 따라 이식 전에 접지선을 전극 커넥터 보드에 납땜해야 할 수도 있습니다. 납땜 인두(400°C)로 도포된 주석 땜납을 사용하여 두 개의 짧은 바니시 절연 구리선에서 절연체를 제거합니다. 접지선을 전극 커넥터 보드의 해당 슬롯에 납땜합니다.
6. 두 개의 추가 구리선 조각의 절연체를 제거합니다. 각 노출된 구리선을 스테인리스 스틸 나사(직경 1mm, 길이 2mm)에 세 번 감습니다. 강철 납땜에 적합한 플럭스를 바르고 구리선을 나사 캡 바닥에 납땜합니다. 나사산의 아래쪽 절반에 주석 땜납이 없는지 확인하십시오.
7. 표준 멀티미터를 사용하여 와이어와 나사 사이의 전기 접촉을 확인하십시오.
8. 실리콘 프로브의 생크와 접지 나사를 70% 에탄올(10초)에 담가 소독합니다.
9. 플라스틱 파스퇴르 피펫의 머리를 반으로 잘라 프로브 임플란트에 대한 보호 덮개를 준비합니다.

2. 이식 수술

1. 뜨거운 구슬 살균기로 수술 기구(가위, 끝이 가는 집게, 수술용 클램프)를 살균하십시오. 70% 에탄올로 모든 표면을 닦습니다.
2. ~1L/min으로 전달되는 산소에서 3% 이소플루란으로 마취를 유도합니다.
   1. 유지 관리를 위해 1 - 1.5% 이소플루란을 사용하십시오. 수술적 내성을 달성하는 데 필요한 이소플루란 농도는 동물마다 다를 수 있습니다.
   2. 안정적인 수술 내성은 동물이 발가락을 꼬집는 것에 반응하지 않을 때 달성됩니다. 마우스의 호흡 속도를 모니터링하고 필요한 경우 이소플루란의 농도를 조정합니다.
   3. 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 연고를 바르십시오.
3. 이어바를 외이도에 부드럽게 삽입하여 입체 프레임에 마우스를 장착합니다. 마우스의 머리가 이어바에 의해 안정화되면 지속적인 이소플루란 전달을 위해 위에 마우스 피스를 놓습니다. 수건이나 패드에 마우스를 올려 가열 패드 위에 놓고 부프레노르핀을 피하주사(체중 0.05 - 0.1 mg/kg)하여 수술 후 진통제를 보장합니다.
4. 표준 면도기로 머리를 면도하고 70% 에탄올로 피부를 소독합니다. 수술용 가위를 사용하여 두개골 정중선을 따라 피부를 절개하고 수술용 클램프를 사용하여 피부를 엽니다.
5. 입체 정렬 도구를 사용하여 동물의 머리를 브레그마와 람다의 수평을 맞추기 위해 정렬합니다. 브레그마와 람다 사이의 높이 오프셋은 50μm 미만이어야 합니다. 또한, 왼쪽과 오른쪽으로 정의된 거리(예: 브레그마의 좌우 1mm)에서 두개골 표면의 브레그마로부터 깊이를 측정하여 내측 축을 따라 머리를 수평으로 맞춥니다. 필요한 경우 머리의 기울기를 조정합니다.
6. 3% 과산화수소로 머리를 청소하고 멸균 면포로 물기를 닦아냅니다.
7. 적절한 입체 아틀라스(stereotaxic atlas)를 사용하여 브레그마에 상대적인 개두술의 위치를 결정합니다.
8. 0.9mm 드릴 헤드를 사용하여 소뇌 위의 뼈에 두 개의 나사 구멍을 뚫어 접지 및 참조 나사를 놓습니다. 또한 고정 나사를 위한 1 - 3개의 구멍은 임플란트를 안정화하는 것이 바람직합니다. 앵커 나사의 위치는 개두술의 위치에 따라 다릅니다. 해마에 이식하려면 반대쪽 두정엽과 동측 전두엽 피질 위에 앵커 나사를 놓습니다. 적절한 드라이버를 사용하여 뼈에 나사를 삽입하십시오. 뇌에 침투하지 않도록 주의하세요.
9. 이식 쪽 주위의 직사각형 영역에서 드릴로 두개골을 천천히 얇게 하여 개두술을 수행합니다. 멸균된 인산염 완충액(PB)으로 뼈를 자주 적십니다. 얇아진 나머지 두개골은 가느다란 주사 바늘(27G)과 핀셋을 사용하여 부드럽게 뚫고 제거할 수 있습니다.
10. 얇은(27G) 주사 바늘로 경막을 조심스럽게 뚫습니다. 핀셋으로 바늘 끝을 구부려 작은 고리를 만들고 경막을 당겨 제거합니다. 뇌 표면이 건조해지는 것을 방지하기 위해 PB를 바르십시오.
11. 전극 삽입 도구를 입체식 홀더에 장착하고 브레그마에서 프로브를 영점화하고 프로브를 개두술 위의 입체성 좌표로 이동합니다. 천천히 뇌 표면을 관통합니다. 프로브 샤프트가 구부러지지 않는지 확인하십시오. 혈관을 통한 착상을 피하십시오.
12. 원하는 깊이에서 ~200μm 위까지 프로브를 천천히 내립니다. 보호를 위해 실리콘 프로브의 개두술과 생크를 멸균된 바셀린으로 덮습니다. 치과용 시멘트를 바르고 프로브 바닥을 두개골의 고정 나사에 고정합니다.
13. 시멘트 도포 직후 프로브를 목표 깊이로 천천히 이동합니다. 시멘트를 도포한 후 마지막 ~200μm를 전진시키면 프로브의 측면 이동이 줄어들고 대상 영역의 조직 손상이 최소화됩니다. 사용된 시멘트의 경화 시간은 프로토콜의 이 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. 빠르게 경화되는 시멘트의 경우 이 단계를 생략하고 실리콘 프로브의 손상을 방지하기 위해 프로브를 목표 깊이에 직접 이식합니다.
14. 시멘트가 경화된 후 소작기로 왁스를 녹여 삽입 도구에서 프로브를 분리합니다.
15. 삽입 장치에서 커넥터 보드를 분리하고 삽입 핸들에 부착된 악어 클램프를 사용하여 두개골의 적절한 위치에 배치합니다. 프로브가 해마에 이식되는 경우, 커넥터 보드를 반대쪽 두정골에 놓습니다. 치과용 시멘트를 사용하여 커넥터 보드를 두개골에 고정합니다.
16. 커넥터 보드의 접지 및 참조 와이어를 소뇌 위의 두 나사에 부착된 와이어에 납땜합니다.
17. 보호 덮개를 올바른 높이로 자르고 실리콘 프로브 위에 놓습니다. 노출된 두개골 주위의 피부를 피하면서 치과용 시멘트를 사용하여 커넥터 보드와 두개골에 덮개를 고정합니다. 이식 부위 주변의 피부를 봉합하는 것은 일반적으로 필요하지 않습니다.

3. 수술 후 회복

1. 최소 2일 동안 적절한 진통제를 적용합니다(예: 낮에는 6시간마다 부프레노르핀의 피하 주사, 밤새 카프로펜(체중 4 - 5mg)과 함께 24시간마다 피하주사). 임플란트의 손상을 방지하기 위해 단일 하우징을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 회복에는 최소 일주일이 소요됩니다. 현지 동물 복지 가이드라인을 참조하세요.

4. 데이터 수집

1. 정류자를 통해 연결된 적절한 데이터 수집 시스템을 사용하여 자유롭게 움직이는 마우스의 LFP를 기록합니다. LFP를 얻으려면 1 - 5kHz의 샘플링 주파수를 사용합니다. LFP와 함께 단일 장치 방전을 기록해야 하는 경우 더 높은 샘플링 속도(20 - 30kHz)가 필요합니다.
2. 오프라인 분석을 위해 개별 채널의 원시 레코딩 파일을 저장합니다.

Results

그림 1: 삽입 도구의 이미지. 실리콘 프로브는 악어 클램프 바닥에 접착된 곤충 핀에 부착되어 있습니다. 홀더의 샤프트는 주입을 위해 입체식 마이크로 매니퓰레이터에 삽입할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
스탠드가 있는 악어 클램프	Reichelt Elektronik	홀터 ZD-10D
실리콘 프로브	케임브리지 뉴로테크	P 시리즈 32
입체경	올림푸스	사이즈51
바니시 절연 구리선	뷔르클린 일렉트로닉	89 F 232
접지 나사	스크류 & 모어 GmbH (screwsandmore.de)	DIN 84 A2 M1x2
유출	스탄놀	114018
세라믹 팁 집게	정밀 과학 도구	11210-60
파라핀 왁스	시그마-알드리치	327204
소작	정밀 과학 도구	18010-00
납땜	커츠 에르사	OIC1300
에탄올	칼 로스	9065.1
파스퇴르 피펫	칼 로스	EA65.1
열살균기	정밀 과학 도구	18000-45
입체식 프레임	데이비드 코프	모델 1900
입체택시 전극 홀더	데이비드 코프	모델 1900
이소플루란	애브비	나506
산소 발생기	레스피로닉스	1020007
부프레노르핀	인디비어 영국 리미티드
전기면도기	톤데오	에코-XS
발열 패드	써모룩스	463265/-67
수술용 클램프	정밀 과학 도구	18050-28
과산화수소	시그마-알드리치	H1009
멸균 면 물티슈	칼 로스	EH12.1
훈련	프록손	마이크로모트 230/E
21G 주사 바늘	B. 브라운	4657527
인산염 완충액/인산염 완충 식염수
입체택시 아틀라스	엘스비어	9.78E+12
수술용 가위	정밀 과학 도구	14094-11
수술용 겸자	정밀 과학 도구	11272-40
27G 주사 바늘	B. 브라운	4657705
바 셀 린
치과 용 시멘트	썬 메디컬	슈퍼본드 T&M
카르프로펜	조에티스	리마딜 50mg/ml
레코딩 앰프	인탄 테크놀로지스	C3323
USB 수집 보드	인탄 테크놀로지스	C3004
레코딩 케이블	인탄 테크놀로지스	C3216 (영문
전기 정류자	Doric 렌즈	HRJ-OE_FC_12_HARW