마우스 망막 절편의 뉴런에서 빛을 유발한 시냅스후 반응(Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices)

초록

출처: Hellmer, C. B., et al. Patch Clamp 기술을 사용하여 Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations에서 뉴런의 빛 유발 시냅스 후 반응을 기록합니다. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 어둡게 적응된 마우스 망막 조직 절편 제제에서 빛을 유발하는 시냅스 후 반응을 기록하는 것을 보여줍니다. 망막 절편은 기록 챔버에 배치되고, 기록 피펫은 망막 신경절 세포와의 전기적 연속성을 확립하는 데 사용됩니다. 광 펄스(light pulses)는 신경절 세포(ganglion cell)에서 흥분성 시냅스후 전위(excitatory post-synaptic potentials)를 생성하기 위해 적용되며, 이는 피펫에 의해 기록됩니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 실험 용액의 준비

1. 실제 실험 1일에서 1주일 전에 해부 용액을 준비합니다. 저온에서 강력한 완충 능력이 있기 때문에 망막 박리를 위해 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 완충 용액을 사용하십시오 16. 모든 화학 물질을 다음과 같이 혼합하십시오 (mM) : 115 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.0 MgCl₂, 10 Hepes, 28 포도당. NaOH로 pH를 7.4로 조정합니다. 용액을 최대 1주일까지 냉장고에 보관하십시오.
2. 기록 솔루션은 망막 준비를 위해 설계된 인공 뇌척수액(aCSF)인 Ames의 배지입니다. 실험 당일까지 튜브에 담긴 에임스 분말(500ml 용액의 경우 4.4g)의 무게를 잰다. 또한 NaHCO₃ (500ml 용액의 경우 0.95g)의 무게를 달아 Ames의 분말과 혼합합니다.
3. 실험 당일까지 패치 클램프 기록을 위해 세포 내 피펫 용액을 준비합니다. 모든 화학 물질을 다음과 같이 혼합합니다 (mM 단위) : 111 K- 글루 콘산염, 1.0 CaCl₂, 10 HEPES, 1.1 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산 (EGTA), 10 NaCl, 1.0 MgCl₂, 5 ATP-Mg 및 1.0 GTP-Na. KOH로 pH를 7.2로 조정합니다. 기존 주사기 필터로 피펫 용액을 여과합니다. ~500μl의 분취량을 만들어 냉동실 또는 급속 냉동고에 보관합니다.

2. 실험의 날 준비

1. 실험 전날 밤, 밤새(O/N) 어둠 적응을 위해 어두운 공간에 있는 우리(C57BL/6J 또는 이와 유사한 배경, 4-8주, 수컷)에 쥐를 놓습니다.
2. 해부 준비:
   1. 유리 비커에 해부 용액(100 - 200 ml)을 채우고 얼음 위에 올려 놓고 최소 10분 동안 산소로 거품을 냅니다.
   2. 망막 준비 보관을 위해 다크 박스의 산소공급을 시작합니다.
   3. 망막 슬라이스 준비를 위해 그리스 레일이 있는 플라스틱 커버슬립을 준비하고 각각을 35mm 플라스틱 접시에 넣습니다.
   4. 새 면도날을 다지기(티슈 슬라이서)에 부착합니다.
   5. 필터 멤브레인을 두 반으로 자릅니다. 이것은 망막 슬라이싱을 위한 것입니다.
   6. 해부 도구를 정렬하고 해부 현미경 근처로 피펫을 옮깁니다. 작업 영역은 어둠 속에서도 각 도구에 쉽게 접근할 수 있도록 잘 구성되어 있어야 합니다.
3. 패치 클램프 녹음 준비:
   1. Ames의 분말과 NaHCO_{3 를} 증류수 (Ames 4.4g 및 NaHCO₃ 0.95g / 500ml ddH₂O)에 용해시킵니다. 기록 온도 수준(~35°C)으로 가열하는 동안 혼합 산소(95% O₂ 및 5% CO₂)로 Ames의 매체를 최소 30분 동안 거품을 일으킵니다. 거품이 나는 동안 NaHCO₃로 pH를 7.4로 조정합니다.
   2. 해부 중 내부 피펫 용액을 해동합니다. 해동 후 세포 내 염색을 위해 0.01% 설포호다민 B를 첨가합니다.

3. Retinal Slice Preparation의 패치 클램프 녹음

1. 녹음 준비:
   1. Ames의 배지로 관류 튜브를 프라임합니다. 튜브를 채울 때 모든 거품이 통과하도록 하십시오.
   2. 풀러로 피펫을 기록하는 패치 클램프를 만듭니다. 피펫에 피펫 용액을 채우려면 피펫 팁이 다시 채워질 때까지 1분 동안 피펫 뒷면에 담그십시오. 다음으로, 마이크로 피펫 필러를 사용하여 피펫의 ~1/3을 채웁니다. 각 피펫은 촉촉한 피펫 상자에 보관하십시오.
   3. 컴퓨터, 증폭기, CCD(전하 결합 장치) 카메라 및 현미경을 포함한 패치 cl 녹음용 장비를 켭니다.
2. 실내 조명을 끕니다. 적외선 뷰어를 사용하여 망막 절편 준비물을 현미경 스테이지 챔버에 놓습니다. 고정한 후 지속적인 관류를 시작하십시오. 관류 온도를 33-37 °C로 설정합니다.
3. CCD 카메라로 슬라이스 표면을 봅니다. 대상 셀 유형이 있는 대상 위치에 초점을 맞춥니다. 패치 클램프 기록을 위해 건강해 보이는 세포를 선택합니다(즉, 표면이 매끄럽고 세포 모양이 좋아야 함).
4. 기록 피펫을 피펫 홀더에 놓습니다. 피펫을 슬라이스 준비로 진행합니다. 슬라이스 준비에 가까우면(위 ~2mm) 현미경으로 피펫 끝을 찾습니다. 현미경에서 피펫 팁이 보이면 팁을 타겟 세포 쪽으로 아래로 이동합니다.
5. 설정 amp리퍼. 피펫을 0 mV/0 pA(영점 조정)로 조정하고 ~10 Hz에서 ~5 mV의 연속 전기 펄스를 시작합니다. 피펫 저항을 확인하십시오. 이상적인 저항은 대부분의 망막 뉴런에 대해 5에서 10MΩ 사이입니다.
6. 끝에서 불어내기 시작합니다. 마우스피스를 사용하거나 주사기를 사용하여 피펫이 수조 용액에 담글 때 양압을 가합니다. 팁이 표적 세포의 표면에 올 때까지 내부 용액을 지속적으로 불어냅니다.
   1. 양압으로 인해 세포 표면에 작은 딤플이 생기면 팁을 약간 앞으로 밀고 분출을 멈춥니다. 증가해야 하는 피펫 저항을 확인하십시오. 지속적으로 증가하면 그대로 두고 >1GΩ(기가씰)에 도달할 때까지 저항을 모니터링하십시오. 저항이 저절로 증가하지 않으면 기가씰이 될 때까지 음압을 부드럽게 가합니다.
7. 기가씰이 달성된 후 유지 전위를 -70mV로 변경합니다. 그런 다음 간헐적으로 음압을 가하여 피펫 팁 내부의 멤브레인을 파열시킵니다. 전체 셀 구성이 이루어질 때 피펫 저항은 500MΩ에서 1GΩ 사이가 될 수 있으며 용량성 전류가 표시됩니다. 때때로 자발적인 시냅스 후 전류가 관찰될 수 있습니다.
8. -80mV에서 +40mV까지 전류-전압(I-V) 관계를 기록합니다. 셀 유형에 따라 다양한 유형의 전압 게이트 채널이 활성화됩니다.
9. 빛을 불러일으키는 시냅스 전류 또는 전압을 기록합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생쥐 (28-60일, 수컷)	잭슨 연구소	C57BL/6J 변형
에임스의 미디엄 파우더	시그마	대답1420	훌륭한
적외선 뷰어	나이트 올빼미 광학 장치	노비그1	밝은 시야를 보여줍니다. 작은 물체의 초점을 맞추는 것이 문제입니다.
적외선 포켓 스코프	B.E. 마이어스	OWL Gen 3 NV 포켓스코프	뛰어난 전망
끌어당기는 사람	셔터	P-1000	훌륭한. 일정한 크기의 피펫을 만드십시오.
다크박스	펠리컨	다크박스	훌륭한
패치 클램프 시스템	사이언티피카	슬라이스 범위 2000	탁월한 설정. 대부분의 주요 구성 요소가 하나의 패키지에 포함되어 있습니다. 미세 조작기는 훌륭합니다.
증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B	우수하고 쉬운 제어.
소프트웨어 구입	분자 장치	pClamp 소프트웨어	우수하고 쉬운 제어.
광원(LED)	쿨 LED	pE-2 4채널 시스템	훌륭한
CCD 카메라	Q-이미징	레티가 2000	훌륭한
패러데이 케이지	손으로 만든

년