Minipigs의 피질 전기생리학 기록을 위한 소프트 전기 피질 판독 어레이의 경막하 이식

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. ECoG(soft electrocorticography) 어레이의 외과적 이식

1. 마취
   1. 투약 전: 암컷 괴팅겐 미니피그(n = 7)를 생후 2-6개월(5-8kg)에 분리하고 밤새 금식시킵니다. 0.75mg/kg의 미다졸람, 0.25μg/kg의 아트로핀, 0.1mg/kg의 할돌을 피내 주사하고 동물이 진정될 때까지 기다립니다. 계속하기 전에 동물의 무게를 측정하십시오.
   2. 정맥(IV) 리드 설치:
      1. 수술대 위에 있는 동물을 발열 패드에 올려 놓습니다. 3%-3.5%의 세보플루란을 사용하여 동물에게 안면 마스크를 씌워 마취를 유도합니다.
      2. 심전도 리드는 복부에, 혈중 포화도 센서는 꼬리에, 온도 센서는 콧구멍에 놓습니다.
      3. IV 리드를 귓정맥에 놓고 식염수로 채워진 주사기를 사용하여 혈액 접근을 확인합니다. 연고를 사용하여 눈의 수분을 유지하십시오.
   3. 삽관: 0.5mg/kg의 아트라큐륨 덩어리, 1mg/kg의 케타민, 1-2μg/kg의 펜타닐을 주입합니다. 삽관을 위해 동물을 등에 눕힙니다. 4.5mm 튜브를 삽입합니다.
   4. 약물 치료: 삽관 후 세보플루란 마취를 중단하고 프로포폴 10mg/kg/h, 펜타닐 2μg/kg/h, 아트라큐륨 0.2-0.5mg/kg/h, 식염수 4-7mg/kg/h를 설치합니다. 수술 중 뇌 부종을 줄이기 위해 1g/kg/h의 속도로 만니톨 주입을 시작합니다.
      참고: 지역 동물 윤리 위원회에서 권장하는 경우 복합 진통제 요법을 사용할 수 있습니다.
2. 무균 영역 및 피부 준비: 수술 영역 너머의 머리 표면 전체를 면도합니다. 멸균 패드를 사용하여 베타딘으로 머리를 철저히 문지릅니다. 다음으로, 기구 테이블과 동물에 멸균 커튼을 놓고 수술 창만 드러나게 합니다. 마지막으로 베타딘을 사용하여 멸균 패드로 머리를 다시 문지릅니다.
3. 개두술과 듀로절개술
   1. 피부 베기: 메스 칼로 정중선을 따라 피부를 절개합니다. 뼈에서 근육과 골막(양쪽 브레그마에서 가로 25mm, 브레그마에서 전방 및 후방 40mm)을 분리하고 스프레더를 배치하여 나중에 드릴링할 때 최적의 접근을 얻습니다.
   2. 측정 및 표시: 브레그마와 람다를 식별하고 멸균 수술용 펜으로 표시합니다(그림 1A, B). 멸균 눈금자를 사용하여 양쪽 반구의 이식 대상을 중심으로 하는 뼈 피판 윤곽을 정의합니다. 이 특별한 경우, 청각 피질이 선택되었으며, 좌표는 브레그마에서 -5mm에서 -15mm, 측면으로 -4mm에서 -20mm입니다. 그런 다음 개두술을 임플란트와 해부학적 랜드마크의 크기에 맞게 조정하여 개구부 크기를 제한합니다.
   3. 개두술:
      1. 둥근 절단 비트가 있는 뼈 드릴을 사용하여 두개골의 두께를 고려하여 개두술의 윤곽을 드릴링합니다. 뼈가 과열되는 것을 방지하기 위해 식염수로 드릴링 위치를 관개하십시오.
      2. 경막에 도달할 때까지 윤곽을 균일하게 조심스럽게 뚫습니다. 첫 번째 돌파구에서 윤곽선이 거의 뚫릴 수 있을 만큼 얇아질 때까지 윤곽선 드릴을 마칩니다. 그런 다음 편평한 주걱(정중선 또는 측면)을 사용하여 개두술 가장자리를 지렛대로 사용하여 뼈 피판을 한 조각으로 절단합니다. 너무 많은 저항이 발생하면 뼈를 계속 얇게 만듭니다.
      3. 뼈 조각을 멸균 식염수에 넣으십시오.
      4. 뼈 피판이 제거되면 날카로운 뼈 가장자리가 경막을 자르지 않도록 케리슨을 사용하여 개두술의 가장자리를 조심스럽게 깎아냅니다.
      5. 경막이나 뼈에 과도한 출혈이 있는 경우 각각 젤폼 또는 뼈 왁스를 사용하십시오. 개두술에 습식 찜질(멸균 식염수에 담긴 표준 패드)을 놓고 다른 반구에서 이 단계를 반복합니다(그림 1B).
   4. 독절개술:
      1. 6-0 봉합 키트의 바늘을 사용하여 내측과 측면 사이의 중간에 있는 개두술의 전방 또는 후방 끝에 있는 경막을 조심스럽게 뚫고 들어 올리고 찌르는 칼로 절개를 시작합니다.
      2. 그런 다음 피질을 보호하는 절단 베이스 역할을 하는 경막하 공간에 삽입된 작고 편평한 주걱을 사용하여 두 도구를 동시에 전진시켜 경막에 전후 슬릿을 만듭니다. 슬릿이 임플란트의 너비보다 약간 큰지 확인합니다(그림 1C). 이 단계에서 출혈이나 손상이 발생하면 젤 폼으로 덮고 멈출 때까지 기다립니다.
         참고: 경막에 큰 혈관이 있는 경우 출혈을 피하기 위해 슬릿 궤적을 조정해야 합니다.
4. 주입
   1. 장치 삽입:
      1. 임플란트(그림 2A)에 식염수를 양쪽에 세척하여 경막하 공간으로 더 쉽게 미끄러지도록 합니다. 임플란트를 경막 슬릿 위에 놓고 작은 집게로 각 가장자리를 순차적으로 밀어 장치를 경막하로 삽입합니다.
      2. 장치의 받침대 끝을 조심스럽게 잡고 삽입을 방해하는 장력이 발생하지 않도록 임플란트를 진행하십시오. 커넥터 가장자리가 슬릿 위에 있으면 삽입을 중지합니다.
   2. 임플란트 고정: 임플란트를 제자리에 고정하려면 개두술 가장자리 또는 앵커링 날개 뒤의 케이블 위에 티타늄 브리지를 놓고 적절한 드라이버를 사용하여 하나 또는 두 개의 티타늄 나사로 고정합니다(그림 1D).
   3. 접지 배치: 접지선의 절연체를 1cm 조심스럽게 제거하고 개두술의 뒤쪽 끝(또는 관심 피질 또는 큰 혈관에서 멀리 떨어진 경막외 위치)에 경막외로 삽입합니다(그림 1E의 와이어).
   4. 반대쪽 반구에서 단계를 반복합니다.
   5. 경막 봉합: 3-0 흡수성 봉합사와 작은 바늘 홀더를 사용하여 임플란트 케이블 주위를 경막을 조심스럽게 봉합합니다. 봉합사선으로 얇은 막을 찢지 않고 두 개의 경막 가장자리를 가능한 한 많이 함께 가져옵니다(그림 1D, E).
   6. 뼈 피판 위치: 티타늄 나사를 사용하여 각 뼈 피판의 전방 및 후방 부분에 티타늄 브리지를 고정합니다. 다음 단계에서 발판 다리의 배치와 관련하여 Ti-브리지의 위치를 계획하도록 주의하십시오. 티타늄 브리지의 끝을 두개골에 나사로 고정합니다(그림 1F, G).
5. 받침대 및 발판 배치
   1. 포지셔닝 : 이 구성에서 발판에는 각각 두 개의 나사 구멍이있는 6 개의 다리가 있습니다 (그림 2B). 나사의 위치를 최적화하기 위해 두개골에 발판의 배치를 계획하십시오(개두술의 가장자리나 측두근에 두지 마십시오). 나사로 조인 수 없는 경우 다리의 구멍을 건너뜁니다.
   2. 발판 고정: 제자리에 단단히 고정될 때까지 발판의 티타늄 나사를 조입니다(그림 1H 참조).
   3. 받침대 배치: 연결 케이블 위의 티타늄 브리지를 제거하고 받침대를 뒤집어 발판에 놓습니다. 받침대를 발판에 나사로 고정합니다. 받침대가 제자리에 단단히 고정되어 있는지 확인하십시오(그림 1I).
6. 봉합 및 봉합
   1. 상처 세척: 식염수로 씻어내어 뼈나 기타 이물질의 피하 공간을 청소합니다. 받침대 가장자리 주변의 피부를 잘라내어 원통을 따라 둥근 가장자리를 만듭니다.
   2. 피하 봉합사: 스프레더를 제거하고 피부 덮개를 함께 접습니다. 간단한 단속 봉합사 또는 간단한 연속 봉합사를 사용하여 4mm 떨어진 3-0 비흡수성 봉합사 와이어로 피하 봉합사를 만듭니다. 받침대에서 멀어지기 시작하여 절개 부위 양쪽에서 받침대 쪽으로 이동합니다.
   3. 피부 봉합사: 봉합사가 5mm 간격으로 6-0 비흡수성 봉합사 와이어를 사용하여 피부를 봉합합니다. 받침대에서 멀어지기 시작하여 절개 부위 양쪽에서 받침대 쪽으로 이동합니다. 공극이 생기지 않도록 두 피부 피판 사이와 받침대 가장자리 근처에 조직이 잘 부착되도록 주의하십시오(그림 1J).
   4. 상처 드레싱: 멸균 패드와 베타딘으로 상처 부위를 다시 청소합니다. 상처 부위에 접착식 멸균 붕대를 감습니다.
7. 각성: 모든 측정이 수행된 후 동물의 모든 마취제를 제거하고 환기를 유지하십시오. 진통의 경우 부프레노르핀 패치(25mg/h)를 24시간 동안 바르십시오. 기상 시간을 단축하기 위해 커튼으로 덮인 가열 패드 위에 동물을 올려 놓습니다. 자발 호흡이 회복되면 동물을 발관시키고 의식이 회복될 때까지 산소 안면 마스크를 착용합니다(1-4시간 소요 가능).
8. 수술 후 동물 관리: 5일 동안 동물을 면밀히 관찰하십시오.세팔렉신을 하루 2회 75mg씩 다른 동물과 분리하여 음식과 함께 투여하십시오. 불린 멸균 패드와 함께 다량의 베타딘을 매일 발라 상처를 소독하십시오(수유 중에 가장 좋습니다).
   메모: 장기 보호 및 주거: 수술된 동물은 24시간 동안 격리되어 보관됩니다. 동물이 동료와 사회적으로 상호 작용할 수 있을 만큼 충분히 건강하면 원래의 사회 집단으로 되돌아갑니다.받침대와 피부 개구부를 매일 관찰하여 머리에 장치를 통합한 상태를 따라야 합니다. 적절한 경우 다량의 베타딘으로 받침대 주변 위치를 청소하십시오.

2. 전기생리학적 기록

1. 자발적인 활동: 받침대를 통해 무선 녹음 시스템을 연결하고 2-3분 동안 기준 활동을 기록합니다. 이러한 녹음은 청각적으로 유발된 전위를 분석하기 위한 제어 역할을 합니다.
2. 청각적 유발 전위: 무선 시스템 외에도 동물의 귀에 있는 닫힌 필드에 스피커를 삽입하십시오. 약 70dB 음압 레벨(SPL)에서 120회 이상 반복하여 다양한 주파수(200-20,000Hz 범위)에서 음향 자극을 재생합니다. 그런 다음 녹음의 평균을 구하고 분석을 위해 자극 기간 동안 정렬합니다.
3. 감각 유발 전위: 주둥이에 있는 바늘을 세 가지 다른 위치에 놓습니다. 모집 곡선을 얻기 위해 다양한 진폭의 펄스 발생기로 주둥이를 ~30초 동안 자극하여 감각 전위를 불러일으
킵니다.

3. 녹음을 자유롭게 이동

1. 뇌의 깨어 있는 신호를 기록하기 위해 섹션 2에 설명된 것과 동일한 절차를 따르십시오. 실험자의 팔에 동물을 안거나 동물의 주의를 산만하게 하기 위해 동물에게 간식을 먹여 무선 헤드스테이지를 연결합니다. 동물 가까이에 배치된 외부 스피커를 사용하여 음향 자극을 제공합니다.

그림 1: 뇌에 소프트 ECoG의 최소 침습적 이식.(A) 브레그마(bregma)의 징후가 있는 두개골에 대한 외과적 접근. (B) 경막이 보이는 양측 개두술. (C) 제1반구에 슬릿 듀로토미. (D) 연질 ECoG 및 경막 봉합의 경막하 이식. (E) 제2반구의 슬릿 듀로절개술. 티타늄 브리지를 사용한 첫 번째 반구에 뼈 플랩 고정. (F) 제2반구에 연질 ECoG 이식 및 경막 폐쇄. (G) 두 번째 반구에 뼈 피판이 고정됩니다. (H) 두개골의 발판 위치. (I) 발판에 받침대 고정. (J) 받침대 바닥 주위의 피부 폐쇄.

그림 2: MRI 호환 받침대. (A) 연전극 어레이에 접근하기 위한 만성 MRI 호환 경피 연결 시스템(받침대). (B) 두개골 고정을 위해 발판에 전극이 장착된 받침대. 삽입 이미지: 발판의 세부 정보입니다.