Mouse Hippocampal-Entorhinal Cortex Slices의 국소장전위(Local Field Potential in Mouse Hippocampal-Entorhinal Cortex Slices) 기록

초록

출처: Whitebirch, A. C. 자발적 해마 네트워크 활동을 조사하기 위한 급성 마우스 뇌 슬라이싱. J. Vis. 특급 (2020)

이 비디오는 쥐 해마-내후각 피질 절편에서 국소장전위(LFP)를 기록하는 절차를 보여줍니다. 전기 자극은 해마의 CA3 방사층에서 제공되며, 이는 CA1 피라미드층에서 시냅스후 전위의 변화를 일으킵니다. 국소장 전위(local field potential)라고 하는 CA1 뉴런의 막전위(membrane potential)의 결합된 변화가 기록되어 있습니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 경심 관류

1. 60mL 용량의 주사기를 벤치탑에서 약 18인치 위에 자당 절단 용액의 저장소로 매달아 놓습니다(예: 수직 포스트에 3구 회전 클램프 사용). 튜브를 저장소 바닥에 부착하고 롤러 cl을 통해 튜브를 실행합니다.amp, 튜브의 다른 쪽 끝을 깨끗한 20g 바늘에 연결합니다.
2. 60mL 용기에 약 30mL의 냉각된 자당 용액을 채우고 탄소 라인을 자당 저장소로 보내 관류물을 지속적으로 거품을 일으킵니다.
   메모: 자당이 갇힌 기포 없이 튜브와 바늘을 통해 흐르고 있는지 확인하십시오. 유속은 바늘에서 떨어지는 자당의 꾸준하고 지속적인 흐름을 가질 수 있을 만큼 충분히 빨라야 합니다.
3. 블렌더를 사용하여 냉동 자당을 부수고 얼음 슬러리에 넣고 큰 주걱/숟가락을 사용하여 슬러리를 분배합니다.
   1. 유리 페트리 접시 뚜껑의 가장자리 주위에 소량의 자당 슬러리를 놓습니다. 페트리 접시 바닥에 소량의 자당 슬러리를 추가합니다.
   2. 대략 20-30mL의 자당 슬러리를 관류 유체 저장소에 추가하고, 저장소에 매우 차갑고 주로 액체 자당과 일부 잔류 동결 용액의 혼합물이 포함될 때까지 30mL의 냉각 액체 자당과 잘 혼합합니다.
4. 마우스를 이소플루란 기화기에 연결된 챔버에 넣습니다. 산소가 약 2L/min으로 흐르는 상태에서 기화기의 다이얼을 돌려 5% 농도의 이소플루란을 전달하고 타이머를 시작합니다.
   메모: 슬라이스하는 동안 이 타이머를 계속 사용하여 슬라이스를 얼마나 빨리 얻을 수 있는지 측정하십시오. 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야 하며, 절단이 완료되고 동물이 이소플루란 챔버에 들어간 후 15-20분 이내에 계면 챔버에서 조직이 회복됩니다. 깊은 마취 상태가 이루어졌는지 확인하기 위해 마우스를 관찰하십시오. 최소 5분 후 마우스는 완전히 마취되고 발가락 꼬집음에 반응하지 않아야 합니다.
5. 이소플루란 챔버에서 마우스를 꺼내기 직전에 페트리 접시 뚜껑에 약 3-5mm 깊이까지 냉각된 자당 용액을 채우고 페트리 접시 바닥에 약 1.0cm 깊이까지 냉각된 자당 용액을 채웁니다.
6. 마우스를 왼쪽 흡수 패드로 빠르게 옮기고 테이프 3개를 사용하여 앞다리와 꼬리를 고정합니다. 절개를 수행하기 전에 마우스가 반응하지 않는지 확인하기 위해 뒷다리 발가락 꼬집기를 수행합니다.큰 조직 집게와 수술 용 가위를 사용하여 피부를 덮고 흉골 바닥에서 가슴 위쪽까지 세로로 절개합니다. 집게를 사용하여 흉골을 위로 당기고 가위를 사용하여 횡격막을 자릅니다.
   메모: 마우스의 초기 위치와 횡격막을 절단하기 위한 처음 몇 번의 절개는 마우스가 의식을 회복하지 않도록 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.절차 전반에 걸쳐 적절한 마취 깊이를 보장하기 위해 마우스에 콧방울을 배치하여 관류 중에 이소플루란을 전달할 수 있습니다.
7. 가위를 사용하여 양쪽의 흉곽을 자르고 앞다리가 몸통과 만나는 지점을 향해 한 번의 큰 동작으로 자릅니다. 집게를 사용하여 흉곽 앞쪽을 머리 쪽으로 위로 휘두른 다음 큰 가위를 사용하여 수평 절단으로 완전히 제거합니다. 큰 겸자를 사용하여 심장을 제자리에 고정하고 20G의 관류 바늘을 좌심실에 삽입합니다. 바늘이 올바른 위치에 놓이면, 심장의 왼쪽이 빠르게 창백해지고, 냉각된 자당 용액이 심실을 채울 것입니다.
8. 작은 해부 가위를 사용하여 우심방을 자르고 혈액이 순환계 밖으로 흘러나오도록 합니다. 절개가 올바르게 수행되면 심장에 대한 손상이 최소화되어야 하며 관류 내내 계속 펌프질해야 합니다.
   메모: 티슈 페이퍼를 말아 올려 심장에서 혈액과 자당 용액을 흡수하고 시술 중에 관류 바늘의 가시성을 유지하는 데 사용할 수 있습니다.
9. 관류 바늘이 제자리에 고정되어 있고 좌심실에서 떨어지지 않는지 확인하십시오. 적절한 유속과 배치를 통해 간은 20-30초 동안 밝은 황갈색/베이지색으로 창백해지기 시작합니다.
10. 30-45초 후에 큰 가위를 사용하여 마우스의 목을 베십시오. 왼손으로 머리를 잡고 두개골에서 피부를 밀거나 벗겨냅니다. 관류가 잘 된 동물의 경우 두개골은 매우 창백해야 하며 뇌는 혈관이 명확하게 보이지 않고 두개골을 통해 매우 밝은 분홍색(흰색에 가까움)으로 보여야 합니다.

2. 뇌를 추출하고 조각을 자른다

1. 작은 Bonn 가위를 사용하여 두개골을 통해 두개골 앞쪽, 눈 근처의 정중선을 향해 두 개의 측면 절단을 만듭니다. 두개골 기저부 양쪽에 두 번 더 자릅니다.
2. 머리를 유리 페트리 접시의 바닥으로 옮겨 식힌 자당 용액에 대부분 담가야 합니다. 작은 본 가위를 사용하여 두개골 길이를 따라 정중선을 자르고 가위로 위로 당겨 아래에 있는 뇌 조직의 손상을 최소화합니다. 작은 조직 겸자를 사용하여 두개골의 양쪽을 단단히 잡고 책을 펴는 것처럼 뇌에서 멀리 떨어뜨립니다.
3. 왼손의 손가락을 사용하여 두개골 덮개를 열고 후각 전구 근처의 뇌 아래에 마이크로 주걱을 삽입합니다. 두개골에서 뇌를 뒤집어 자당으로 들어가 마이크로 주걱을 사용하여 뇌간을 절단합니다. 뇌를 씻어 남아 있는 혈액, 털 또는 기타 조직을 제거합니다.
4. 큰 주걱/숟가락을 사용하여 뇌를 유리 페트리 접시의 뚜껑으로 옮깁니다. 양날 면도날의 나머지 절반을 미리 치워둔 상태에서 관상동맥을 두 번 절개하여 먼저 소뇌를 제거한 다음 후각구를 포함한 뇌의 가장 앞쪽 부분을 제거합니다(그림 1).
5. 한천 램프에 시아노아크릴레이트 접착제를 바릅니다. 큰 조직 겸자를 사용하여 마른 여과지 조각에 뇌를 아주 짧게 놓은 다음 즉시 한천 램프로 옮겨 뇌의 복부 표면을 접착제 위에 놓습니다.
   메모: 중간 해마 조각의 경우, 뇌는 앞쪽이 경사로의 경사면을 향하도록 하고 뒤쪽은 블레이드에 더 가깝게 방향을 잡아야 합니다. 복부 해마 조각의 경우, 앞쪽 끝이 경사로의 경사면을 향하도록 뇌의 방향을 잡고, 뒤쪽 끝이 경사로의 위쪽에 있고 블레이드에서 더 멀리 떨어지도록 합니다. 두 경우 모두 뇌는 관상으로 절단된 뇌 표면이 한천 배킹 블록과 접촉하도록 경사로의 맨 위에 위치해야 합니다(그림 1).
6. 한천과 뇌가 있는 슬라이싱 플랫폼을 마이크로톰의 슬라이싱 챔버에 놓고 식힌 자당 용액으로 완전히 담그십시오. 큰 주걱 / 숟가락을 사용하여 일부 자당 슬러리를 챔버로 옮기고 저어 동결 된 자당을 녹이고 혼합물의 온도를 ~ 1-2 ° C로 빠르게 낮추십시오 .
   메모: 슬라이스하는 동안 온도 게이지를 관찰하십시오. 자당 용액이 3 ° C 이상으로 따뜻해지면 슬러리를 더 넣고 섞어 온도를 다시 낮추십시오.
7. 마이크로톰 속도를 0.07mm/s로 설정하여 450μm 두께로 슬라이스를 자릅니다. 각 절편이 제거될 때 작은 조직 겸자와 날카로운 메스를 사용하여 먼저 두 반구를 분리한 다음 절편이 주로 해마와 해마 부근 영역으로 구성될 때까지 조직을 잘라냅니다(그림 1).
8. 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 절편을 개별적으로 계면 회수 챔버로 옮기고, 절편을 덮고 있는 얇은 인공 뇌척수액(ACSF)으로 ACSF와 공기의 경계면에 절편이 위치하도록 합니다. 챔버의 뚜껑을 단단히 닫고 32°C에서 30분 동안 슬라이스가 회복되도록 합니다.
9. 32°C에서 초기 회수 후 계면 회수 챔버를 수조에서 꺼내고 자기 교반 막대가 챔버 내에서 ACSF의 순환을 촉진하도록 저속으로 설정된 교반기에 놓습니다. 슬라이스가 추가로 90분 동안 회복되는 동안 실온으로 서서히 식히십시오. 회수 챔버에 탄수화물이 지속적으로 거품이 일고 있는지 확인하고 큰 거품이 슬라이스 아래에 갇히지 않도록 하십시오.

3. 자발적인 활동의 LFP(Local Field Potential) 기록 수행

1. 수집 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터, 컴퓨터에 연결된 모니터, 자극기, 미세 조작기, 온도 컨트롤러, 현미경 광원, 현미경 부착 카메라, 미세 전극 증폭기, 디지타이저 및 연동 펌프를 포함하여 필요한 모든 장비를 켜서 LFP 녹음을 준비합니다. 중앙 진공 시스템을 사용하는 경우 벽 밸브를 열어 기록 챔버에서 ACSF를 제거할 진공 라인을 준비합니다.
2. 가열된 용기에 ACSF를 채운 다음 튜브의 한쪽 끝을 거품이 나는 ACSF가 들어 있는 400mL 비커에 넣습니다. 연동 펌프를 켜서 ACSF를 400mL 비커에서 가열된 용기로, 그리고 용기에서 기록 챔버로 향하게 합니다. 튜브를 두드리거나 꼬집어 갇힌 기포를 제거합니다.
3. 연동 펌프를 조정하여 기록 챔버를 통한 ACSF 유속이 빠르도록(~ 8–10mL/분) 합니다. 온도 프로브를 사용하여 ACSF가 기록 챔버 중앙에서 32°C인지 확인하십시오.
   메모: 연동 펌프를 사용하여 ACSF가 기록 챔버로 전달되는 경우, 높은 유속으로 인해 유속의 상당한 변동이 발생할 수 있습니다. 튜브에 통합된 일련의 빈 주사기로 구성된 간단한 맥동 댐퍼를 사용하여 일관된 유속을 달성할 수 있습니다(그림 2).
4. 가열된 필라멘트 풀러를 사용하여 붕규산 유리 모세관에서 자극을 준비하고 피펫을 기록합니다. 풀러 프로토콜은 자극 또는 국소 전위 기록 전극을 위해 2–3 MOhm의 저항을 가진 피펫을 생성하도록 구성되어야 합니다.
5. 자극 피펫은 1 M NaCl로, LFP 피펫은 ACSF로 충진합니다.
6. 간단히 clamp 튜브를 만들고 펌프를 꺼서 ACSF의 흐름을 일시 중지합니다. 미세한 집게를 사용하여 슬라이스가 놓여 있는 렌즈 용지의 모서리를 잡고 슬라이스를 기록 챔버로 옮기면 슬라이스가 렌즈 용지에 달라붙습니다. 렌즈 용지를 놓고 슬라이스가 아래를 향하도록 하여 레코딩 챔버에 슬라이스를 넣은 다음 렌즈 용지를 "벗겨내고" 슬라이스를 레코딩 챔버에 담근다. harp.
   를 사용하여 슬라이스를 고정합니다. 메모: 하프는 미리 제작되어 구입하거나 U자형 스테인리스 스틸 또는 백금 및 미세한 나일론 필라멘트를 사용하여 실험실에서 만들 수 있습니다.
7. NaCl로 채워진 자극 피펫을 수동 마이크로매니퓰레이터에 놓고 피펫 끝을 약 30–45° 각도로 슬라이스 표면(예: 방사선층)으로 천천히 전진시킵니다. 피펫의 끝이 조직에 들어가면 피펫을 천천히 앞으로 전진시키고 슬라이스 내의 축삭을 불필요하게 손상시킬 수 있는 측면 또는 수직 방향의 큰 움직임을 삼가십시오. 파이펫 끝을 슬라이스에 최소 50–100μm 깊이로 놓아 슬라이스 중에 손상된 표면 근처의 세포를 방지합니다.
8. ACSF로 채워진 LFP 피펫을 전동 마이크로매니퓰레이터에 부착된 피펫 홀더에 넣습니다. 입 압력 또는 스토콕 밸브를 통해 연결된 1mL 주사기를 사용하여 매우 가벼운 양압을 가하고 파이펫 홀더에 짧은 길이의 튜브를 적용합니다.
   메모: 관심 신호를 기록하기 위해 슬라이스 내에 LFP 피펫을 배치합니다: 날카로운 파동 잔물결의 경우 하나의 LFP 피펫을 피라미드층(SP)에 배치하고 두 번째 피펫을 라디아툼층(SR)에 배치해야 합니다. 이 구성을 사용하면 SR의 음의 샤프파와 SP의 고주파 리플 진동을 동시에 기록할 수 있습니다(그림 3).
9. micromanipulator를 사용하여 LFP 피펫의 끝을 약 30–45° 각도로 관심 영역(예: CA1 피라미드 세포층)으로 천천히 전진시킵니다. 파이펫 끝을 슬라이스에 최소 50–100μm 깊이로 놓아 슬라이스 중에 손상된 표면 근처의 세포를 방지합니다. LFP 파이펫을 진행하는 동안 수집 소프트웨어를 사용하여 작은 전압 테스트 펄스를 지속적으로 전달하고 전극 저항의 급격한 증가를 관찰합니다. 이는 피펫이 막혔거나 셀에 눌렸음을 나타낼 수 있습니다.
10. LFP 피펫이 관심 영역에 배치되면 피펫 홀더에 부착된 튜브의 밸브를 열어 양압을 조심스럽게 해제합니다.
11. 두 번째 위치에서 LFP를 동시에 기록하려면 두 번째 피펫과 마이크로 매니퓰레이터로 6.8–6.10단계를 반복합니다.
12. 전류 클램프 구성에서 microelectrode ampliifier를 사용하여 피펫의 직렬 저항을 보정하기 위해 수집 소프트웨어의 브리지 밸런스 기능을 사용한 후 국소 자기장 전위의 자발적인 활동을 기록합니다. 자발적인 샤프파 리플(SWR)은 SP 층의 세포 외 전위에서 양의 편향으로 나타납니다(그림 3).
13. 유발된 자기장 전위를 기록하려면 디지타이저에 연결된 자극기를 사용하여 NaCl로 채워진 자극 피펫을 통해 짧은(200us) 구형전압 펄스를 전달합니다. 다양한 응답 진폭을 불러오도록 자극 전압 다이얼을 조정합니다.

결과

그림 1: 수평 각도의 해마-내후피질(HEC) 절편의 준비. (가)(i) 뇌를 적출한 후 면도날로 뇌의 후방과 전방을 제거하기 위해 두 번의 관상 절개를 수행합니다. (ii) 한천 램프는 마이크로톰 슬라이싱 플랫폼에 접착된 두 개의 각진 부분으로 형성됩니다. 중간 해마 조각을 준비하려면 뇌 블록을 앞쪽 표면이 경사면을 향하고 경사로의 높은 뒤쪽 부분과 접촉하도록 한천 경사로에 놓습니다. 더 많은 복부 해마 조각을 준비하려면 전방 표면이 경사면을 향하도록 하여 뇌 블록을 한천 경사로에 배치하여 후방 절단 표면이 경사로의 높은 등받이 부분과 접촉하도록 합니다. (iii) 각 조각이 풀리면 메스로 여러 번...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
급성 뇌 절편 배양 홀더	NIH 3D 프린팅 교환	3DPX-001623	ChiaMing Lee가 디자인했으며 https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 에서 구매 가능
아데노신 5'-트리포스페이트 마그네슘 염	시그마 알드리치	A9187-500MG
Ag-Cl 그라운드 펠릿	워너	64-1309년, (E205)
한천	Becton, 디킨슨	214530-500지
아스코르브산	알파 에자르	36237
비커(250mL)	키맥스	14000-250
비커(400mL)	키맥스	14000-400
바이오사이틴	시그마 알드리치	나4261
믹서	오스터	BRLY07-B00-NP0
본 가위, 소	becton, 디킨슨	14184-09
필라멘트가 있는 붕규산 유리 모세관(O.D. 1.5mm, I.D. 0.86mm, 길이 10cm)	셔터 기기	BF150-86-10마력	화염 연마 모세관이 바람직합니다.
염화칼슘 용액 (1M)	G-바이오사이언스	R040
사진기	올림푸스	올리-150
압축 탄화 가스 (95 % 산소 / 5 % 이산화탄소)	에어가스	X02OX95C2003102
압축 산소	에어가스	황소 200
정전압 절연 자극기	디지타이머	DS2A-Mk.II
커버슬립(22x50mm)	폭스바겐	16004-314
시아노아크릴레이트 접착제	크레이지 글루	KG925	이상적으로는 정밀도를 위해 브러시 온 형태를 사용하십시오
데이터 수집 소프트웨어	액소그래프	해당 사항 없음	동등한 소프트웨어(예: pClamp)가 작동합니다.
Dell Precision T1500 타워 워크스테이션 데스크탑	작은 골짜기	해당 사항 없음	카탈로그 번호는 특정 컴퓨터에 따라 다르며, 전기생리학 수집 소프트웨어를 실행할 수 있는 한 모든 컴퓨터에서 작동합니다.
디지데이터 1440A	분자 장치	1-2950-0367
디지털 타이머	폭스바겐	62344-641	4채널 추적 가능 타이머
일회용 흡수 패드	폭스바겐	56616-018
해부기구 가위	정밀 과학 도구	14082-09
양날 면도날	페르소나	BP9020
이중 자동 온도 조절기	워너 인스트루먼트 코퍼레이션	TC-344B
Dual-Surface 또는 Laminar-Flow Optimized 레코딩 챔버	해당 사항 없음	해당 사항 없음	이 프로토콜에 제시된 챔버는 맞춤형으로 제작됩니다. 상업적으로 동등한 것은 Warner Instruments의 RC-27L입니다.
장비 랙	과학 자동화	FR-EQ70"	랙은 반드시 필요한 것은 아니지만 전기 생리학을 구성하는 데 유용합니다
에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에티 에테르) - N, N, N', N'- 테트라 아세트산 (EGTA)	시그마 알드리치	324626-25GM
여과지	왓맨	1004년 070
미세 조정	메틀러 톨레도	XS204DR
화염/갈색 마이크로피펫 풀러	셔터 기기	P-97
유리 페트리 접시 (100 × 15mm)	코 닝	3160-101
포도당	피셔 사이언티픽	라16-1
구아노신 5'-트리포스페이트 나트륨 염 수화물	시그마 알드리치	G8877-250MG
얼음 양동이	시그마 알드리치	BAM168072002-1개
이소플루란 기화기	전신 마취 서비스	테크 3
실험실 테이프	피셔 사이언티픽	15-901-10알
렌즈 종이	피셔 사이언티픽	11-996
광원	올림푸스	TH4-100
염화마그네슘 용액 (1M)	고품질 생물학	351-033-721EA
마그네틱 교반 바	피셔 사이언티픽	번호: 14-513-56	카탈로그 번호는 교반 막대의 크기에 따라 다릅니다.
마이크로 매니퓰레이터	루이그스 & 노이만	SM-5
MicroManipulator (수동)	사이언티피카	LBM-2000-00
현미경	올림푸스	BX51WI
마이크로스파츌라	정밀 과학 도구	10089-11
모니터	작은 골짜기	2007FPB
MultiClamp 700B 미세 전극 증폭기	분자 장치	멀티클램프 700B	MultiClamp 700B에는 헤드스테이지, 피펫 홀더 및 모델 셀이 포함되어야 합니다.
N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산), (헤페스)	시그마 알드리치	H3375-25G
바늘(20게이지, 길이 1.5인치)	Becton, 디킨슨	305176
나일론 필라멘트	YLI 원더 인비저블 스레드	Tel.: 212-15-004	크기 0.004. 이 고양이. #은 Amazon.com 에서 온 것입니다.
나일론 메쉬	워너 인스트루먼트 코퍼레이션	우편번호 64-0198
퍼스트랄틱 펌프	하버드 기구	70-2027
포스포크레아틴 디(트리스) 염	시그마 알드리치	P1937-1G
피펫 홀더	분자 장치	1-HL-U
백금 와이어	세계 정밀도	PT0203
폴리락트산(PLA) 필라멘트	얼티메이커	RAL 9010
염화칼륨	시그마 알드리치	P3911-500G
글루콘산 칼륨	시그마 알드리치	1550001-200MG
수산화칼륨	시그마 알드리치	60377-1KG
면도날	폭스바겐	55411-050
롤러 클램프	세계적인 정밀 기기	14041
저울	메틀러 톨레도	오후2000
메스 손잡이	정밀 과학 도구	10004-13
슬라이스 하프	워너	SHD-26GH/2
중탄산나트륨	피셔 케미컬	시즌 233-500
소금	시그마 알드리치	S9888-1KG
인산나트륨 monobasic 무수	피셔 케미컬	시즌 369-500
나트륨 피루브산	피셔 케미컬	BP356-100
주걱	폭스바겐	82027-520
주걱/숟가락, 대형	폭스바겐	제470149-442
멸균 메스 블레이드	깃털	72044-10
교반기 / 핫 플레이트	코 닝	6795-220
스톱콕 밸브, 1방향	세계적인 정밀 기기	14054
스톱콕 밸브, 3방향	세계적인 정밀 기기	14036
자당	아크로스 오가닉스	AC177142500
스위블 클램프 지원	피셔 사이언티픽	14-679큐
수술용 가위, 날카롭거나 뭉툭한 가위	정밀 과학 도구	14001-12
주사기(1mL)	Becton, 디킨슨	309659
주사기(Luer-Lok 팁 포함 60mL)	Becton, 디킨슨	309653
3구 클램프	피셔 사이언티픽	05-769-8Q
조직 겸자, 대형	정밀 과학 도구	11021-15
조직 겸자, 작은	정밀 과학 도구	11023-10
파이펫 이송	피셔 사이언티픽	13-711-7엠
배관	타이곤	E-3603	ID 1/16 인치, OD 3/16 인치
배관	타이곤	R-3603	ID 1/8 인치, OD 1/4 인치
진공 그리스	다우코닝	14-635-5D
진동 칼날 마이크로톰	라이카	VT 1200S
패러데이 케이지가 있는 진동 흡수 테이블	마이크로 G / TMC-아메텍	2536-516-4-30PE
부피 측정 플라스크(1L)	키맥스	김-28014-1000
부피 플라스크(2L)	파이렉스	65640-2000
따뜻한 물 목욕	폭스바겐	1209